目的肥胖是由于机体能量摄入和消耗的平衡失常,导致脂肪沉积而影响健康的一种病理状态。营养物质的消化与吸收在胃肠道中进行与完成,胃肠动力功能直接或间接影响机体的能量代谢平衡,而肠道炎症是导致胃肠动力异常的重要影响因素。积极采取措施干预肠道炎症是改善胃肠动力功能,治疗胰岛素抵抗(IR)性肥胖的关键。因此,本实验在前期研究的基础上,以胰岛素抵抗性肥胖大鼠为研究对象,从小肠沉默信息调节因子1(SIRT1)调控核因子κB(NF-κB)介导的抗炎通路入手,研究电针通过调控肠道炎症改善胰岛素抵抗性肥胖胃肠动力功能的分子机制。方法8周龄SPF级Wistar雄性大鼠120只,随机挑选15只大鼠喂养普通饲料,其余105只大鼠均喂养高脂饲料进行造模。8周后,随机挑选普通饲料喂养的大鼠13只作为正常组,随机挑选造模成功的大鼠65只分别纳入模型组、电针组、电针联合抑制剂组(针加抑组),抑制剂组、激动剂组,每组13只。每组随机选取3只进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹术检测全身胰岛素敏感性以判断是否造模成功。然后给予每组不同的干预措施。(1)正常组:普通饲料喂养,不给予其他干预。(2)模型组:高脂饲料喂养,不给予其他干预。(3)电针组:选取足(后)三里、丰隆、中脘、关元穴,接韩氏电针仪,2Hz,1mA,连续波。10分钟/次,3次/周,共8周。(4)针加抑组:电针和SIRT1抑制剂联合干预。电针干预方案同电针组;SIRT1抑制剂干预方案:根据大鼠体重,通过尾静脉注射Sirtinol抑制剂溶液(剂量为1mg/kg)给药。3次/周,共8周。(5)SIRT1抑制剂组:根据大鼠体重,通过尾静脉注射Sirtinol抑制剂溶液(剂量为1mg/kg)给药。3次/周,共8周。(6)SIRT1激动剂组:根据大鼠体重,给予大鼠白藜芦醇溶液(剂量为200mg/kg)灌胃治疗。3次/周,共8周。干预过程中,在第0、2、4、6、8周等各时间点测量大鼠的体重、24小时进食量、肛鼻长。同时,计算Lee’s指数。第6周检测每组大鼠的腹腔胰岛素耐量(IPITT)和腹腔糖耐量(IPGTT)。干预8周后,行钳夹术评估大鼠全身胰岛素敏感性。取材前,各组大鼠选取1只检测其胃和小肠肌生物电慢波,各组挑选2只进行胃排空、小肠推进率检测。取血清检测胰岛素和CRP含量;取新鲜小肠组织,运用免疫印迹法检测SIRT1、TNF-α、IL-6、乙酰化NF-κB(Ac-NF-κB)的蛋白表达量,实时荧光定量PCR法(RT-PCR)法检测SIRT1、TNF-α、IL-6的基因表达,免疫荧光双标法检测SIRT1/Ac-NF-κB在小肠细胞中共表达的情况,并对数据进行统计学分析。结果1.电针对IR性肥胖大鼠的体重、进食量、胰岛素敏感性及血清CRP的影响(1)体重结果:整个干预过程中,除激动剂组和电针组外,其余各组大鼠的体重均呈明显上升趋势。干预前(0周),与正常组相比,模型组大鼠体重显著升高(P<0.01),且大于正常组的20%以上。与模型组相比,第4周开始激动剂组体重开始下降(P<0.05),第6周开始电针组和激动剂组大鼠的体重显著下降(P<0.01);针加抑组和抑制剂组大鼠体重与模型组无显著差异(P>0.05),但从第6周开始显著高于电针组的体重(P<0.01)。(2)Lee’s指数结果:干预前(0周),与正常组相比,高脂饲料喂养的各组大鼠Lee’s指数均显著升高(P<0.01);与模型组相比,从第6周开始,电针组和激动剂组大鼠的Lee’s指数开始下降,且有统计学意义(P<0.05,P<0.01);抑制剂组和针加抑组大鼠的Lee’s指数与模型组比无显著差异(P>0.05)。与电针组相比,针加抑组从第6周开始,抑制剂组在第8周显著升高(P<0.05,P<0.01)。(3)进食量结果:整个干预过程中,模型组大鼠的进食量明显高于正常组,且具有统计学差异(P<0.01)。干预前(0周),与正常组相比,模型组大鼠进食量显著升高(P<0.01)。与模型组相比,从第4周开始,电针组和激动剂组大鼠的进食量开始下降,且有显著差异(P<0.01),说明电针和SIRT1激动剂能够降低肥胖大鼠的进食量,抑制剂组和针加抑组大鼠的进食量无显著差异(P>0.05)。与电针组相比,从第2周开始针加抑组和抑制剂组的进食量显著升高(P<0.05,P<0.01)。(4)血清胰岛素结果:干预结束后,与正常组相比,模型组大鼠血清胰岛素水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,电针组和SIRT1激动剂组肥胖大鼠的血清胰岛素水平明显降低(P<0.01),针加抑组、抑制剂组大鼠血清胰岛素水平无显著差异(P>0.05)。与电针组相比,抑制剂组大鼠血清胰岛素水平显著降低(P<0.01),激动剂组无显著差异(P>0.05)。(5)IPGTT实验结果:各组大鼠空腹状态下血糖无显著差异。腹腔注射葡萄糖15分钟后,大鼠血糖快速升高,30分钟达到峰值,然后逐渐下降。与正常组相比,从30分钟开始直到120分钟结束,高脂饲料喂养的大鼠血糖始终高于正常组(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,激动剂组从第15分钟开始、电针组从30分钟开始直到第120分钟结束血糖始终较低(P<0.05),从第15分钟到第120分钟之内,针加抑组大鼠的血糖指均低于模型组,但在第120分钟时有统计学意义;抑制剂组大鼠血糖从第30分钟开始直到结束均高于模型组,在第120分钟时具有统计学意义。与电针组相比,从第15分钟开始直到结束,激动剂组血糖一直较低,但无统计学意义;从第30分钟开始抑制剂组大鼠血糖一直较高(P<0.01);针加抑组从第15分钟开始,血糖高于电针组和激动剂组,但低于模型组和抑制剂组。(6)IPITT实验结果:各组大鼠空腹状态下血糖无显著差异。腹腔注射胰岛素15分钟后,所有大鼠血糖快速下降,60分钟后下降到最低,然后逐步上升。其中,激动剂组、电针组、正常组下降最快,而模型组、抑制剂组和针加抑组大鼠血糖下降较慢。与正常组相比,从15分钟开始直到120分钟结束,高脂饲料喂养的大鼠血糖均高于正常组(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,从第15分钟开始激动剂组和电针组大鼠的血糖始终较低(P<0.05);针加抑组和抑制剂组没有显著性差异(P>0.05),但从第15分钟开始血糖值高于电针组低于模型组。与电针组相比,从第30分钟开始,激动剂组血糖稍低(P<0.05);抑制剂组血糖显著高于电针组(P<0.01),针加抑组从第60分钟开始明显高于电针组(P<0.01)。(7)GIR结果:在干预前(0周),与正常组相比,模型组大鼠的GIR明显降低(P<0.01),且低于正常组的20%以上。干预8周后,电针组和SIRT1激动剂组大鼠GIR相比干预前显著升高(P<0.01);正常组大鼠相比干预前GIR无显著变化(P>0.05)。干预结束后,与正常组相比,模型组大鼠的GIR显著降低(P<0.01);与模型组相比,电针组、激动剂组的GIR非常显著升高(P<0.01);针加抑组较模型组有所升高(P<0.05)。(8)血清CRP结果:与正常组相比,模型组大鼠血清CRP显著升高(P<0.01)。与模型组相比,电针、SIRT1激动剂和针加抑剂组血清CRP水平显著下降(P<0.01)。与电针组相比,抑制剂组大鼠血清CRP水平明显升高(P<0.01),针加抑组大鼠血清CRP水平介于电针组和模型组之间。2.电针对IR性肥胖大鼠胃及小肠肌生物电波、胃排空、小肠推进率的影响(1)胃肌生物电波:与正常组相比,模型组大鼠胃肌电慢波的振幅与频率均显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,电针组和激动剂组大鼠胃肌电慢波振幅与频率均下降(P<0.05,P<0.01),针加抑组、抑制剂组大鼠的胃肌电慢波振幅与频率无显著差异(P>0.05),提示SIRT1抑制剂反转了电针的效应,说明电针对胃电的影响是通过激活SIRT1发挥作用。(2)小肠肌生物电波:与正常组相比,模型组大鼠小肠肌电慢波的振幅升高,频率下降,且均有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,电针组和激动剂组大鼠小肠肌电慢波振幅下降,而频率增快(P<0.05,P<0.01),说明电针对大鼠小肠肌电的效应与SIRT1激动剂一致;针加抑组和抑制剂组小肠肌慢波振幅与频率无显著变化(P>0.05),提示抑制剂反转了电针对小肠肌电的调节效应,进而说明电针对小肠电的影响是通过激活SIRT1实现的。与电针组相比,抑制剂组小肠肌电慢波振幅高,频率较小,且差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(3)胃排空率和小肠推进率:与正常组相比,模型组大鼠的胃排空率上升,小肠推进率下降(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,电针组和SIRT1激动剂组大鼠的胃排空率下降,而小肠推进率上升(P<0.05),针加抑组和抑制剂组无显著差异(P>0.05),但针加抑组大鼠的胃排空率和小肠推进率变化介于电针组与模型组之间,提示SIRT1抑制剂反转了电针对胃排空和小肠推进率的调节效应,说明电针通过激活SIRT1发挥对胃和小肠的这种效应。与电针组相比,针加抑组和抑制剂组大鼠的胃排空率明显上升,小肠推进率下降(P<0.05,P<0.01)。3.电针对IR性肥胖大鼠小肠组织中Ac-NF-κB及其下游炎症因子TNF-α、IL-6表达的影响(1)TNF-α、IL-6蛋白表达:与正常组相比,模型组小肠组织中TNF-α和IL-6蛋白的表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组和激动剂组大鼠小肠组织中TNF-α和IL-6蛋白的表达显著下降(P<0.01,P<0.05);针加抑制剂组小肠组织中TNF-α和IL-6的蛋白表达量降低,其中TNF-α下降具有统计学意义(P<0.05),IL-6的变化无统计学意义(P>0.05),抑制剂组无显著差异(P>0.05),这说明SIRT1抑制剂阻断了电针降低IR性肥胖大鼠小肠组织炎症因子TNF-α和IL-6蛋白表达的作用,进而反证电针通过激活SIRT1发挥降低炎症因子的效应。与电针组相比,抑制剂组大鼠小肠组织中TNF-α和IL-6的蛋白表达量明显升高(P<0.01,P<0.05),针加抑组中TNF-α和IL-6的蛋白表达量无显著差异(P>0.05),激动剂组大鼠小肠组织中TNF-α和IL-6的蛋白表达量与电针组相比无差异(P>0.05)。(2)Ac-NF-κB蛋白表达:与正常组相比,模型组小肠组织中Ac-NF-κB蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组和激动剂组大鼠小肠组织中的Ac-NFκB的表达量显著下降(P<0.05,P<0.01),抑制剂组和针加抑组小肠组织中Ac-NFκB的蛋白表达量无显著差异(P>0.05),说明SIRT1特异性抑制剂阻断了电针降低NF-κB乙酰化的作用。与电针组相比,针加抑组小肠组织中Ac-NF-κB蛋白的表达量有升高,但无统计学意义(P>0.05);抑制剂组小肠组织中Ac-NF-κB蛋白的表达量显著升高(P<0.05);激动剂组大鼠小肠组织中Ac-NF-κB蛋白的表达量无显著差异(P>0.05)。(3)TNF-α、IL-6的基因表达结果:与正常组相比,模型组小肠组织中TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量显著增高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,电针组和激动剂组大鼠小肠组织中TNF-α和IL-6 mRNA的表达显著下降(P<0.05,P<0.01),抑制剂组和针加抑组无显著差异(P>0.05),说明SIRT1抑制剂阻断了电针下调TNF-α和IL-6基因表达的作用。与电针组相比,抑制剂组大鼠小肠组织中TNF-α和IL-6 mRNA的相对表达量均升高(P<0.05,P<0.01);激动剂组小肠组织中TNF-α和IL-6 mRNA的表达无显著差异(P>0.05)。4.电针对IR性肥胖大鼠小肠组织中SIRT1表达及在细胞核中SIRT1/Ac-NF-κB共表达的影响(1)SIRT1的蛋白表达结果:与正常组相比,模型组小肠组织中SIRT1的蛋白表达量显著下降(P<0.01)。与模型组相比,电针组和激动剂组大鼠小肠组织中SIRT1蛋白的表达显著上升(P<0.05,P<0.01),针加抑组、抑制剂组大鼠小肠组织中SIRT1蛋白的表达量无显著差异(P>0.05),提示SIRT1抑制剂阻断了电针上调SIRT1蛋白表达的作用,进而说明电针能够上调SIRT1的蛋白表达。与电针组相比,抑制剂组大鼠小肠组织中SIRT1蛋白表达量显著下降(P<0.05),激动剂组小肠组织中SIRT1蛋白表达无显著差异(P>0.05)。(2)SIRT1的基因表达:与正常组相比,模型组小肠组织中SIRT1的mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)。与模型组相比,电针组和激动剂组大鼠小肠组织中SIRT1的mRNA表达显著上升(P<0.01),抑制剂组小肠组织中SIRT1的mRNA表达无显著变化(P>0.05),针加抑组SIRT1蛋白的表达升高(P<0.05),但低于电针组,提示SIRT1抑制剂阻断了电针上调SIRT1基因表达的作用,进而说明电针具有上调SIRT1基因表达的作用。与电针组相比,抑制剂组大鼠小肠组织中SIRT1蛋白的mRNA相对表达量显著下降(P<0.01),激动剂组小肠组织中SIRT1的mRNA表达无显著差异(P>0.05)。(3)SIRT1/Ac-NF-κB共表达:从每组400X倍镜中可见,SIRT1与Ac-NF-κB在小肠细胞核中共表达。由SIRT1/Ac-NF-κB的比值(以下简称比值)可知,与正常组相比,模型组大鼠的比值显著降低(P<0.01)。与模型组相比,电针组和激动剂组的比值明显升高(P<0.05),抑制剂组的比值无明显差异(P>0.05),针加抑组的比值较模型升高,但低于电针组。结论1.电针能够降低IR性肥胖大鼠的体重,减少其进食量,提高胰岛素敏感性。电针的这种作用与其上调SIRT1蛋白的表达有关。2.电针能够降低IR性肥胖大鼠血清CRP水平,提示电针具有系统性抗炎作用。3.电针对IR性肥胖大鼠胃肠运动具有双向调节作用,进而改善其胃肠动力紊乱。即电针可抑制胃运动,减慢胃排空,又可降低小肠的蠕动强度,加快小肠推进率。4.电针能够上调IR性肥胖大鼠小肠组织中SIRT1的蛋白和基因表达,去乙酰化作用于NF-κB,下调其通路下游的炎症因子基因表达,降低小肠组织中炎症因子TNF-α和IL-6蛋白的表达水平,从而改善小肠炎症。5.电针与SIRT1激动剂具有相当的生物效应,同时电针的这种效应能够被SIRT1特异性抑制剂阻断,说明电针调控的靶点是SIRT1。综上所述,电针能够特异性的上调IR性肥胖大鼠小肠组织中SIRT1蛋白的表达水平,去乙酰化作用于NF-κB,抑制其介导的炎症信号通路,降低炎症因子TNF-α和IL-6的表达,缓解小肠炎症,进而改善胃肠动力紊乱,为临床针灸治疗IR性胃肠动力异常及肥胖相关疾病提供了实验依据。