论文部分内容阅读
研究背景先天免疫是单细胞生物到高等动物普遍具有的一种抵御外界病原微生物入侵的天然防御机制,是宿主进行自我保护的基础。无脊椎动物中只存在有先天免疫系统,之前在果蝇和线虫为代表的模式生物中对先天免疫系统的研究取得了较大进展。近年来,以对虾为代表的海洋无脊椎动物养殖业迅速发展,但由病原微生物引起的各种疾病给这些养殖业带来了巨大损失。所以,我们研究对虾的先天免疫机制,旨在为相关产业的病害防治提供理论上的依据和技术上的支持。研究的科学问题及意义已知,在需氧生物中,由过氧化氢酶,过氧化物还原酶和超氧化物歧化酶等组成的酶促反应抗氧化系统在生物体的先天免疫应答中发挥着重要作用。我们前期的研究结果表明,过氧化物还原酶4(Peroxiredoxin,Prx4),作为一类多功能的、广泛分布的硫醇依赖性的抗氧化蛋白,可以参与到对虾抗病毒免疫过程中。但是其分子机制尚不明确。本论文研究发现WSSV感染可以促进对虾Prx4蛋白分泌到血淋巴中,作为损伤相关分子模式(Damage-associated signaling molecules,DAMPs)促进血细胞中NF-kappa B转录因子的同源蛋白Dorsal入核,启动几种抗脂多糖因子类抗菌肽基因的表达。并且进一步证明这些抗菌肽基因在日本囊对虾抗病毒免疫中发挥着重要作用,可以抑制WSSV的复制。此外,本论文还鉴定了Prx4的直接电子供体硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并且研究了其在对虾抗病毒免疫中的功能,发现Trx可以通过还原氧化态Prx4促进其抗病毒免疫功能。这是首次鉴定了一种在对虾抗病毒免疫中发挥功能的危险相关分子模式蛋白,拓展了对抗氧化蛋白Prx4的功能认识,为了解对虾的抗病毒免疫机理和开发相关的抗WSSV感染药物用于养殖实践提供了重要帮助。研究结果1、日本囊对虾的Prx4(MjPrx4)可以作为DAMPs通过Dorsal-AMPs(Antimicrobial peptides)途径抑制病毒的复制我们发现WSSV感染可以促进MjPrx4蛋白在对虾免疫器官中的上调表达和在血淋巴中的分泌。体内注射活性MjPrx4蛋白能够促进核因子κκB(Nuclear factor kappaB,NF-κB)同源蛋白 Dorsal 入核及相关抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)基因的表达。使用RNA干扰技术敲低对虾体内MjPrx4的表达或抗体封闭MjPrx4都可以抑制MjDorsal入核,从而使MjPrx4依赖的下游抗菌肽基因AMPs的表达受到抑制。而体内注射纯化的MjPrx4活性蛋白则有相反的功能。利用RNA干扰(RNAi)技术敲低对虾体内Prx4依赖的AMPs的表达,导致病毒病毒复制量增多,表明相关抗菌肽基因在抑制病毒复制中发挥重要功能。本研究首次证明了 WSSV病毒感染可以诱导MjPrx4分泌进入血淋巴,作为DAMPs分子通过促进MjDorsal入核,诱导相关AMPs基因的表达,抑制病毒WSSV的复制。2、MjTrx可以促进对虾的抗病毒免疫,并促进MjPrx4的抗病毒功能首先克隆得到了 Prx4酶促循环系统中的电子供体硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)在日本囊对虾中的同源基因,称为MjTrx。该基因的cDNA全长为518 bp,其完整开放阅读框共有315 bp碱基对,编码由105个氨基酸组成的蛋白序列。并且Trx在WSSV感染的对虾中的表达量分析显示,WSSV感染可以促进MjTrx在多种组织中表达量显著上调。利用纯化的MjTrx重组蛋白和MjPrx4重组蛋白构建的体外酶促反应表明,MjTrx可以增强MjPrx4的酶活性。进一步在对虾体内过表达MjPrx、MjTrx、以及MjPrx+MjTrx,均可抑制WSSV病毒基因iel的转录,并且过表达MjPrx+MjTrx组的效应相对于其他两组更为明显,说明MjTrx可以促进MjPrx4的抗病毒能力。体内实验表明,RNAi实验敲低MjTrx后,WSSV的入侵会使对虾死亡率升高。而回补MjPrx、MjTrx、以及MjPrx+MjTrx蛋白能够显著增强对虾的存活率,其中MjPrx+MjTrx蛋白组的效果最明显,证明MjTrx可以促进对虾的抗病毒免疫和MjPrx4的抗病毒效果。研究的创新点本论文主要研究并阐明了Prx4在对虾中的抗WSSV免疫的分子机理。创新点总结为如下:(1)首次证明MjPrx4具有DAMPs的分子功能,并且阐明其发挥功能的具体机理是通过促进转录因子Dorsal入核,进而诱导相关抗病毒抗菌肽(AMPs)基因的表达,抑制病毒WSSV的复制。(2)证明了MjTrx蛋白在恢复MjPrx4酶活性中发挥的重要作用并且阐明了两种蛋白在对虾抗病毒免疫中的功能与联系。