TNFAIP3siRNA对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞NF-κB活性及药物敏感性的影响

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目的:研究A20的小分子干扰RNA片段(small interfering RNA,siRNA)对弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)OCI-LY1细胞株增殖及长春新碱(vincristine, VCR)对MDR1表达和功能的影响。  方法:采用RNA干扰技术沉默A20,设计三条针对人A20 mRNA的siRNA序列,经过lipofectamine RNAi-MAX转染至OCI-LY1细胞,用Real time PCR, Western blot检测转染后OCI-LY1细胞内A20的mRNA和蛋白的表达,筛选出高效的siRNA序列,进行后续实验;MTT法筛选VCR作用细胞的最佳药物浓度及作用时间,了解用药前后转染细胞和未转染细胞体外增殖情况。流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)了解OCI-LY1细胞用药前后的凋亡情况。Real time PCR检测A20基因及MDR1基因mRNA的表达情况。Western-blot检测A20蛋白、NF-κB(p65)蛋白、Pgp蛋白表达。  结果:1. OCI-LY1细胞经A20 siRNA转染后A20核酸及蛋白表达均降低,其中siRNA-2序列最明显,选其进行后续实验。2. VCR5个浓度梯度[8、0.8、0.08、0.008、0.0008(μg/ml)]分别作用细胞,培养24h、48h、72h,筛选出0.008μg/ml,24h为最佳药物浓度及作用时间。3. siRNA-2转染细胞后,细胞增殖能力增强(P=0.000),VCR刺激后细胞生长曲线呈下降趋势,转染细胞的下降趋势较未转染细胞下降缓慢。4.细胞凋亡检测:转染细胞凋亡率明显低于未转染细胞,VCR刺激24h后细胞凋亡率较加药前明显增加(P<0.05),未转染细胞加药后的凋亡率比转染细胞加药后增高的幅度大(P=0.000)。5.转染后A20 mRNA表达明显下降(P=0.000),MDR1 mRNA的表达则明显增强(P=0.000)。加药前后A20 mRNA表达无明显差异(P>0.05),MDR1的表达则降低(P<0.05),未转染细胞加药组较转染加药组降低幅度大(P=0.001)。6.蛋白表达检测:转染后A20蛋白表达明显降低(P=0.000),NF-κB(p65)蛋白(P=0.000)和Pgp(P=0.001)表达则增高。用药前后A20蛋白和NF-κB(p65)表达无明显差异(P>0.05),但Pgp表达较用药前有所降低,未转染细胞加药组较转染加药组降低的幅度大(P=0.008)。  结论:A20 siRNA能有效的增强OCI-LY1细胞内NF-κB的表达,使得MDR1基因及编码蛋白Pgp表达增强,从而抑制细胞凋亡,促进细胞生长;VCR刺激后细胞内MDR1 mRNA和Pgp的表达明显降低,A20 siRNA则减弱了VCR的这一作用。
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