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胰腺癌是一种消化系统恶性肿瘤，由于胰腺生理位置隐秘，胰腺癌早期诊断困难，出现症状时多数已属晚期并且极易向多器官转移，使手术切除治疗变得十分困难，从而导致胰腺癌死亡率极高。即使近年来医疗水平在不断进步，胰腺癌的5年生存率仅由5%上升到8%，其治疗及预后仍然不够乐观。 化疗是胰腺癌辅助治疗的重要手段，作为标准一线化疗药物，吉西他滨（Gemcitabine，dFdC）治疗胰腺癌的总有效率小于20%，约80%的患者在1年内因肿瘤转移而死亡，上皮来源的肿瘤细胞获得干性而产生的耐药是吉西他滨化疗失败的根本原因。肿瘤细胞经历上皮间质转化（ Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）可以演进形成肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs），CSCs逃逸吉西他滨的化疗毒性，成为癌症转移和复发的种子细胞。因此，识别干性的重要调控分子揭示其作用的分子基础将为逆转吉西他滨耐药，设计胰腺癌靶向精准干预策略奠定理论基础和实验依据。 本论文为了研究长链非编码 RNA 在胰腺癌耐药、EMT 和 CSCs 中的功能及其作用机制，通过8轮浓度倍增的吉西他滨处理胰腺癌敏感细胞BxPC-3，在前 4 轮的筛选中观察到大量细胞死亡，余下的少量细胞体积较小且呈梭形，呈现间质样形态，耗时 16 个月后建立了获得性胰腺癌耐药细胞株 BxPC-3-Gem，将该细胞株长期保存在吉西他滨浓度为 50 nmol/L 的培养基中。对获得的胰腺癌耐药细胞株进行EMT和CSC特征分析发现，耐药细胞E-Cadherin表达下调， vimentin表达上调，并且呈现CSCs识别特征，表现为成球与克隆形成能力明显增强，干细胞标志基因Oct4，Lin28，Nanog和Sox2表达显著提高，表明对吉西他滨敏感的胰腺癌细胞演进为耐药细胞过程中发生EMT并获得干细胞特性。 通过高通量芯片分析发现，基因间RNA linc-DYNC2H1-4在吉西他滨耐药细胞株与敏感母系间表达差异极为显著，qPCR 证实其在吉西他滨敏感细胞株BxPC-3 和 MIA PaCa-2 中表达水平较低，而在获得性吉西他滨耐药细胞株BxPC-3-Gem 和天然耐药细胞株 AsPC-1、PANC-1 中表达水平均显著上升。通过 RT-qPCR 初步分析确认与 linc-DYNC2H1-4 在正链上位置最近的基因DYNC2H1的表达在耐药细胞和敏感母系间不存在显著差异，而其负链邻近基因MMP家族中，MMP3、MMP27和MMP1的表达在两细胞系间存在显著差异，其中MMP3差异最为显著，且蛋白水平上升明显。 对linc-DYNC2H1-4在胰腺癌细胞耐药、EMT和CSCs方面的功能检测中，首先沉默胰腺癌耐药细胞中的linc-DYNC2H1-4，检测MMP3的表达情况及EMT和CSC特征。发现沉默linc-DYNC2H1-4后，MMP3的mRNA和蛋白表达水平降低；EMT和CSC特性下降：EMT和CSC标志物ZEB1、vimentin、Lin28、Oct4、Sox2、Nanog表达下降，E-cadherin表达增多，胰腺癌细胞的迁移和侵袭程度，成球与克隆形成能力均明显降低。在胰腺癌敏感细胞中过表达linc-DYNC2H1-4后会得到相反的结果，说明linc-DYNC2H1-4能够促进胰腺癌细胞EMT和CSC能力的获得。 进一步探讨linc-DYNC2H1-4促进胰腺癌细胞EMT和CSC表型形成的分子机制。发现linc-DYNC2H1-4定位于细胞质，提示linc-DYNC2H1-4可能作为sponge吸附miRNA。经生物信息预测，linc-DYNC2H1-4与miR-145有两段互补序列，分别并且同时突变 linc-DYNC2H1-4 中的两段预测序列，构建双荧光素酶报告载体，检测 linc-DYNC2H1-4的相对荧光强度发现 miR-145通过第一段互补序列与 linc-DYNC2H1-4 结合。随后，在胰腺癌耐药细胞中过表达miR-145，发现linc-DYNC2H1-4的表达随之降低；而过表达胰腺癌敏感细胞中的 linc-DYNC2H1-4 后 miR-145 的表达也下降；在胰腺癌耐药细胞中沉默linc-DYNC2H1-4后检测到miR-145的表达水平升高。并且发现linc-DYNC2H1-4和 miR-145 在不同胰腺癌细胞中的本底表达水平相反，说明 linc-DYNC2H1-4竞争性结合miR-145。 据报道miR-145靶向CSC标志物Lin28、Oct4、Sox2和Nanog。另有报道， miR-145可以靶向EMT标志物ZEB1，进而上调vimentin并抑制E-cadherin的表达。过表达miR-145后MMP3表达降低，并且双荧光素酶报告系统实验证实miR-145通过靶向MMP3 3UTR抑制MMP3的表达。在胰腺癌细胞中分别过表达 linc-DYNC2H1-4、miR-145、linc-DYNC2H1-4+miR-145 以进行回复实验，发现过表达linc-DYNC2H1-4引起胰腺癌细胞CSC标志物Lin28、Oct4、Sox2、Nanog，EMT标志物 ZEB1，vimentin和MMP3表达增高，而E-cadherin表达降低，细胞迁移和侵袭程度升高；过表达miR-145会引起相反效果；当两者共表达时，胰腺癌细胞的CSCs和EMT标志因子表达水平和细胞迁移侵袭程度趋同于没有高表达linc-DYNC2H1-4和miR-145的对照组，Transwell实验和克隆形成实验亦支持以上结果，说明linc-DYNC2H1-4能够作为sponge干预miR-145在分子和细胞水平对胰腺癌细胞EMT和CSCs的抑制作用。 综上所述，本文建立了获得性胰腺癌耐药细胞株 BxPC-3-Gem ，发现linc-DYNC2H1-4 在吉西他滨耐药细胞株与敏感母系表达差异极为显著，并且linc-DYNC2H1-4能够作为 sponge 干预 miR-145在分子和细胞水平对胰腺癌耐药细胞EMT和CSCs的抑制作用，从而促进干细胞的形成。