[研究背景]鸢尾素（irisin）主要由肌肉组织分泌,是含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5（fibronectin typeⅢ domain-containing protein 5,FNDC5）经过蛋白水解酶水解后形成的可分泌入血的多肽片段。鸢尾素对于代谢以及心血管系统疾病都具有重要的影响。鸢尾素可以促进白色脂肪组织棕色化,促进能量的消耗和热量的产生,改善糖尿病小鼠糖脂代谢、胰岛素抵抗。大量研究报道2型糖尿病患者的血清鸢尾素水平是下调的,并且鸢尾素的水平与糖尿病的症状呈负相关。研究报道,鸢尾素可抑制小鼠动脉粥样硬化的形成,鸢尾素可促进心梗后心肌组织微血管新生改善心梗后心功能。然而,鸢尾素在心力衰竭中的作用和机制目前尚不完全清楚。心力衰竭可分为射血分数保留的心衰（HFpEF）和射血分数下降的心衰（HFrEF）。总体上,这两种心力衰竭的发病率和死亡率相似。积极寻找治疗HFpEF和HFrEF的治疗策略具有重要意义。射血分数保留的心衰（HFpEF）占所有心衰病例的50%左右。HFpEF的治疗还缺乏突破。糖尿病是导致HFpEF的常见病因。糖尿病心肌病是糖尿病心血管并发症之一,其最初的临床表现是射血分数保留的心衰（HFpEF）,即只表现为心脏舒张功能障碍而收缩功能正常或接近正常。及时发现并干预舒张功能障碍对于延缓心衰的发展至关重要。大量研究表明,超氧化物会损伤组织细胞。超氧化物与一氧化氮结合后会生成毒性很强的过氧亚硝基阴离子（ONOOT）,引发脂质、蛋白质和核酸的广泛损伤。氧化/硝化应激在糖尿病心肌病发生发展中发挥重要作用,被认为是糖尿病及其并发症的共同通路和中心环节。鸢尾素能否通过抑制氧化/硝化应激改善糖尿病心肌病,目前尚无报道。左心室射血分数低于40%的心力衰竭被称为射血分数下降的心衰（HFrEF）。缺血性心脏病是导致HFrEF最常见的病因。如何有效控制心梗后心衰的发生发展仍是亟待解决的问题。心肌梗死后心脏病理性重构是导致心衰的重要原因,巨噬细胞极化在调控心脏病理性重构作用中发挥重要作用。促进巨噬细胞向M2型极化有利于心梗后心肌组织的修复。鸢尾素能否调控心肌梗死后心脏巨噬细胞极化,目前尚无报道。据此,我们提出:鸢尾素是否影响糖尿病心肌病所致HFpEF的发生发展、以及心梗所致HFrEF的发生发展?提高FNDC5的表达或者外源性补充鸢尾素能否减轻糖尿病心肌病所致HFpEF的发展以及心梗所致HFrEF的发展?FNDC5/鸢尾素发挥保护作用的机制是什么?本研究通过在体和体外实验研究FNDC5/鸢尾素在2型糖尿病引起的糖尿病心肌病中的作用及可能机制。同时,通过构建心梗模型,研究鸢尾素对于心梗后巨噬细胞的数量、巨噬细胞的极化、心脏病理性重构和心脏功能有无影响,并在细胞实验上筛选可能的分子机制。[研究目的]（一）FNDC5/鸢尾素与 HFpEF1.心肌过表达FNDC5或外源补充鸢尾素对2型糖尿病导致的糖尿病心肌病是否具有治疗作用。细胞水平研究FNDC5/鸢尾素能否发挥直接的心肌细胞保护作用。2.在高糖/高脂培养的心肌细胞中验证鸢尾素发挥细胞保护作用的分子机制。（二）FNDC5/鸢尾素与 HFrEF1.心肌过表达FNDC5是否减轻心梗后心脏病理性重构,并影响心脏巨噬细胞数量以及心脏巨噬细胞的极化。2.鸢尾素调控巨噬细胞极化的分子机制。[研究方法]（一）FNDC5/鸢尾素与 HFpEF第一部分:心肌过表达FNDC5或外源补充鸢尾素对小鼠糖尿病心肌病的在体治疗作用;细胞实验验证FNDC5/鸢尾素的心肌细胞保护作用1.为明确FNDC5/鸢尾素在糖尿病心肌病中表达水平的变化,我们检测喂养16周的db/db小鼠以及db/+小鼠左心室FNDC5/鸢尾素的蛋白表达以及血浆鸢尾素的水平。2.为明确FNDC5/鸢尾素能否减轻糖尿病心肌病,采用db/db小鼠喂养16周的方法构建糖尿病心肌病模型。使用心肌点注射FNDC5过表达腺病毒或腹腔植入式渗透泵补充外源性鸢尾素（0.25 μg/g体重/天）治疗4周。心脏超声检测心脏舒张和收缩功能、Western blot和TUNEL法检测心肌细胞凋亡、天狼猩红染色检测心脏纤维化、WGA染色检测心肌肥厚。同时观察FNDC5/鸢尾素对心肌组织线粒体超微结构的影响。3.为明确FNDC5/鸢尾素是否影响糖尿病心肌病心肌组织氧化应激水平,检测心肌组织NOX2、iNOS蛋白表达。4.采用高糖/高脂（25 mM葡萄糖,300 μM棕榈酸钠）培养基处理H9C2细胞和大鼠乳鼠心肌细胞,体外模拟2型糖尿病进行损伤造模。给予H9C2细胞鸢尾素处理（1 μg/mL）,给予大鼠乳鼠心肌细胞FNDC5过表达腺病毒处理。Western blot和TUNEL法检测细胞凋亡、JC-1染色检测细胞线粒体膜电位、Western blot检测线粒体细胞色素C的释放,观察FNDC5/鸢尾素对心肌细胞线粒体依赖凋亡通路的影响。为明确FNDC5/鸢尾素是否影响心肌细胞氧化/硝化应激水平,Western blot检测心肌细胞NOX2、iNOS以及3-NT的蛋白表达水平。第二部分:鸢尾素减轻高糖/高脂导致的心肌细胞凋亡和氧化/硝化应激的分子机制1.为明确整合素αV/β5受体是否参与鸢尾素的心肌保护作用,使用小干扰RNA抑制H9C2细胞整合素αV/β5的表达,再使用鸢尾素和高糖/高脂共孵育,采用Western blot和流式细胞术检测鸢尾素抑制细胞氧化/硝化应激和细胞凋亡的保护作用是否削弱。2.为明确AKT是否是鸢尾素发挥细胞保护作用的信号分子,使用AKT抑制剂处理H9C2细胞,再使用鸢尾素和高糖/高脂共孵育,采用Western blot和流式细胞术检测鸢尾素减轻细胞氧化/硝化应激和细胞凋亡的作用是否削弱。（二）FNDC5/鸢尾素与 HFrEF第三部分:心肌过表达FNDC5减轻MI后心脏病理性重构,改善心功能并促进巨噬细胞M2极化1.为明确MI后心肌组织FNDC5/鸢尾素的表达水平变化,Western blot检测MI后第1、3、7天左心室FNDC5/鸢尾素的蛋白表达水平。2.为明确FNDC5能否减轻MI后心脏病理性重构,采用过表达FNDC5腺病毒进行心肌点注射,再进行MI造模,观察FNDC5过表达对于MI后心脏纤维化、心脏肥厚、微血管新生的影响。心脏超声检测心功能,观察FNDC5对于MI后心功能的影响。3.为明确心肌过表达FNDC5是否影响MI后巨噬细胞的数量和极化,采用C57BL/6J小鼠,先进行60Co-γ射线照射,接受GFP小鼠骨髓细胞移植（BMT）,再进行MI造模,即分为两组:（1）BMTAd-con MI7d 组（2）BMTAd-FNDC5 MI7d 组。采用免疫荧光染色和流式细胞术检测心肌组织GFP阳性细胞数量、GFP和F4/80双阳性细胞（巨噬细胞）数量来观察FNDC5对MI后细胞的募集是否有影响,以及GFP和F4/80双阳性细胞中M1标志物（iNOS）或M2标志物（Arg-1）表达水平,来判断FNDC5对MI后心脏巨噬细胞极化的影响。第四部分:鸢尾素调控巨噬细胞极化及其机制1.为明确鸢尾素能否调控巨噬细胞极化,使用LPS处理RAW264.7细胞使其向M1极化,并给予鸢尾素孵育,观察M1相关标志物的mRNA和蛋白表达水平的变化。使用鸢尾素孵育RAW264.7细胞,观察M2相关标志物的mRNA和蛋白表达水平的变化。2.为明确鸢尾素调节巨噬细胞极化的机制,我们从本课题组前期研究的转录组测序结果入手,筛选鸢尾素调控巨噬细胞极化的可能机制。使用小干扰RNA分别抑制IRAK-3和SOCS3,观察鸢尾素促进M2极化的作用是否削弱。使用小干扰RNA抑制NFKBIA观察鸢尾素抑制M1极化的作用是否削弱。使用小干扰RNA抑制整合素αV/β5观察鸢尾素抑制M1极化、促进M2极化的作用是否削弱。[研究结果]（一）FNDC5/鸢尾素与 HFpEF1.与db/+小鼠相比,16周龄db/db小鼠左心室心肌FNDC5和鸢尾素的蛋白表达水平显著降低,血浆鸢尾素水平显著降低。与db/+小鼠相比,16周龄db/db小鼠出现心肌间质纤维化、心肌肥厚、舒张功能障碍,收缩功能没有统计学差异。经心肌过表达FNDC5或者补充外源性鸢尾素治疗4周后,db/db小鼠心脏舒张功能障碍、心肌间质纤维化、心肌肥厚显著改善。糖尿病心肌线粒体数量和大小异常、电子密度降低、嵴断裂等超微结构损害得到了改善。心肌过表达FNDC5或补充外源鸢尾素可增加db/db小鼠血浆鸢尾素水平。心肌过表达FNDC5或补充外源性鸢尾素可降低db/db小鼠心肌组织iNOS和NOX2的蛋白表达水平。高糖/高脂可诱导H9C2细胞线粒体膜电位下降、线粒体细胞色素C释放入胞浆及细胞凋亡,FNDC5/鸢尾素可减轻上述变化。高糖/高脂导致H9C2细胞、大鼠乳鼠心肌细胞氧化/硝化应激水平增加（iNOS和NOX2、3-NT表达增加）,可被鸢尾素或过表达FNDC5所抑制。2.小干扰RNA抑制H9C2细胞整合素αV/β5表达后,鸢尾素减轻高糖/高脂导致的细胞氧化/硝化应激和细胞凋亡的作用减弱。MK2206抑制H9C2细胞AKT磷酸化,鸢尾素减轻高糖/高脂导致的细胞氧化/硝化应激和细胞凋亡的作用减弱。提示鸢尾素通过整合素αV/β5-AKT发挥作用。（二）FNDC5/鸢尾素与 HFrEF1.与Sham组相比,MI后1、3、7天左心室FNDC5和鸢尾素的蛋白表达水平降低。心肌过表达FNDC5可减轻MI后心肌纤维化、心脏肥厚,改善微血管新生和收缩功能。与BMT Ad-con MI 7d组相比,BMT Ad-FNDC5 MI 7d组GFP阳性细胞比例增加,GFP和F4/80双阳性细胞比例增加。说明心肌过表达FNDC5能促进MI后细胞的募集、增加巨噬细胞的比例。在梗死区GFP和F4/80双阳性细胞中,iNOS阳性细胞比例降低,而Arg-1阳性细胞比例增加。说明心肌过表达FNDC5能促进MI后心脏巨噬细胞向M2极化。使用鸢尾素孵育小鼠原代骨髓巨噬细胞,CSF2RB蛋白表达水平增加,可能是FNDC5介导细胞募集的分子机制。2.使用RAW264.7细胞进行实验。与CON组相比,LPS组M1标志物IL-6、CCL2、CXCL10、IL-1β、TNF-α mRNA水平显著增加。与LPS组相比,LPS+irisin组上述基因表达显著下降。与CON组相比,LPS组CD86和iNOS蛋白表达水平显著增加,与LPS组相比,LPS+irisin组上述分子蛋白表达水平显著下降。与CON组相比,irisin组Arg-1和Fizz-1的mRNA和蛋白表达水平显著增加。提示鸢尾素可以抑制M1极化、促进M2极化。3.小干扰RNA抑制IRAK-3的表达可部分阻断鸢尾素促进SOCS3表达和M2极化的作用。小干扰RNA抑制SOCS3的表达可部分阻断鸢尾素促进M2极化的作用。使用小干扰RNA抑制NFKBIA（IκB）可部分阻断鸢尾素抑制M1极化的作用。使用小干扰RNA抑制整合素αV/β5,鸢尾素增加IκB、IRAK-3和SOCS3的作用均减弱,且鸢尾素抑制M1极化、促进M2极化的作用均减弱。初步提示鸢尾素通过整合素αV/β5-IκB途径抑制巨噬细胞M1极化,并通过整合素αV/β5-IRAK-3-SOCS3途径促进巨噬细胞M2极化。[结论]1.在2型糖尿病引起的糖尿病心肌病中,心肌组织FNDC5/鸢尾素的蛋白表达水平显著降低。心肌过表达FNDC5或者外源补充鸢尾素均可增加循环鸢尾素的水平。FNDC5/鸢尾素减轻糖尿病心肌病心肌细胞凋亡、氧化应激、心肌肥厚和心肌纤维化,改善心脏舒张功能。FNDC5/鸢尾素可减轻高糖/高脂导致的心肌细胞氧化/硝化应激和细胞凋亡。2.鸢尾素通过整合素αV/β5受体-AKT信号通路减轻高糖/高脂导致的氧化/硝化应激和线粒体依赖的细胞凋亡。3.小鼠心肌梗死后,心肌组织FNDC5/鸢尾素的蛋白表达水平显著降低。心肌过表达FNDC5可以减轻心梗后心肌病理性重构、改善心脏收缩功能。心肌过表达FNDC5可增加心梗后血液单核细胞来源的巨噬细胞向心脏募集,CSF2RB是FNDC5发挥募集作用的潜在分子机制。4.心肌过表达FNDC5可促进心梗后巨噬细胞向抗炎型（M2型）极化。鸢尾素通过整合素αV/β5受体-IκB途径抑制巨噬细胞M1极化,并通过整合素αV/β5受体-IRAK3-SOCS3途径促进巨噬细胞M2极化。