研究背景及目的卵泡(Follicular)是哺乳动物卵巢内的基本单位,为卵母细胞生长发育以及成熟提供微环境。人类及多数哺乳动物卵巢内卵泡数目会随年龄增长不断减少。女性一生中,只有少数卵泡能够发育成熟、排卵。其余大部分在发育不同阶段经闭锁退化而消失。卵泡闭锁(Follicular Atresia)是指卵泡发育到一定的阶段后停止发育并退化的现象。哺乳动物的卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程。人卵泡闭锁可出现在不同发育时期。雌性哺乳动物在胚胎发育期,开始形成最早的原始卵泡;在出生前后双侧卵巢具有大量的卵泡,性成熟后大多数卵泡发生闭锁退化,只有少部分卵泡能发育成熟并排卵。卵泡发育的每一个阶段都可以发生闭锁,其中原始卵泡闭锁较为少见,初级卵泡闭锁最多。卵泡的闭锁在整个脊椎动物中均有发现,对于维持卵巢内环境的稳定具有重要意义。雄激素主要是通过雄激素受体(Androgen receptor,AR)发挥其生物学作用。在啮齿类动物卵巢中,卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞均可以检测到雄激素受体的表达。其中在卵泡膜细胞中表达最为丰富,颗粒细胞次之。雄激素受体在小卵泡(即初级卵泡和窦前卵泡)中表达较高,随着卵泡的发育,雄激素受体的表达逐渐减少。雄激素是影响卵泡发育的关键调节因子,其中睾酮可以促进初级卵泡的FSH(Follicle Stimulating Hormone,FSH)受体mRNA表达增加,从而促进卵泡生长。众所周知,FSH和E2(Estrogen)是影响卵泡生长发育的主要因素,雄激素能够增加颗粒细胞对于FSH的反应性,有助于卵泡的继续生存发育。研究表明,高雄激素环境可以减少卵泡发育到成熟,甚至对形成胚胎后的正常发育有一定影响。多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女常见的严重内分泌紊乱疾病,以无排卵、高雄激素为主要特征,其发病率约为5%-10%。其中高雄激素血症是其主要的内分泌特点。多囊卵巢综合征患者不论是在青春期或育龄期,卵巢中均因血清或生化水平的雄激素过高,从而抑制卵泡发育成熟导致排卵稀发或无排卵,在其临床表现为月经稀发、闭经,或婚后不孕;并伴见多毛、脱发、痤疮、肥胖等特症。而另一种卵泡发育异常相关的疾病为卵巢早衰(premature ovary syndrome,POF),是指女性在40岁之前发生提前更年期的现象。也就是卵巢中的卵泡因为本身储备数目减少而不足或者卵泡的发育进程加快而导致过度过快的卵泡消耗,而最终导致卵巢中卵泡提前耗竭的现象。而该疾病的发生可能跟卵泡的生存能力下降而导致卵泡发育进程加快,卵泡过度耗竭有关。因此,卵泡的发育及闭锁是多因素参与调控的复杂过程。研究卵泡的发育和闭锁机制可以为卵巢皮质组织的体外培养和卵母细胞体外成熟培养提供理论依据,为进一步完善超数排卵和活体采卵技术提供相应的理论支持,对于提高动物繁殖力和胚胎工程发展有着十分重要的意义。搞清人卵泡发育的相关调控机制,阐明如多囊卵巢综合症及卵巢早衰等与卵泡发育异常而导致的排卵障碍相关疾病的发病机理,并且对提高辅助生殖助孕技术的妊娠率具有相应的指导意义。第一部分 雄激素代谢相关基因多态性与卵泡发育疾病的关联性研究目的:探讨雄激素代谢相关基因多态性与PCOS发病的相关性。方法:临床上收集475名多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)患者和537名非PCOS正常妇女的血液标本,并记录她们的临床指征,包括:年龄、初潮年龄、身高、体重、生殖激素水平等。通过不同的方法来检测基因的单核苷酸多态性(SNP):1、特异引物聚合酶链式反应(PCR)扩增后限制性内切酶酶切(PCR-RFLP)2、使用Taqman探针进行单倍型标签SNP(TagSNP)基因分型。3、使用毛细管电泳法(CE)对基因的微卫星多态性进行检测(即简单序列重复,SSR)。比较分布频率在患者和正常中的差异,并且对所有样本进行单倍型分析。数据统计分析采用SPSS 18.0、HaploView等处理软件。结果:各基因位点均符合Hardy-Weinberg平衡检验。1、CYP11A1基因的 7 个 TagSNPs 中,rs4077582 和 rs11632698 这两个 SNP 位点和PCOS的发病有一定的相关性(P=0.010和P=0.026)。其中,GTACAGG单倍型可能增加PCOS的发病风险(OR=1.181,95%CI:0.89～1.56),而ACGCAAG单倍型和GCACGAA单倍型可能起到保护的作用(OR=0.624,95%CI:0.43～0.92;OR=0.672,95%CI:0.46～0.97)2、CYP19a1基因的21个TagSNsP中,有7个和PCOS的发病有相关性,尤其是 rs12591359(P=7.05E-011)和 rs2445761(P=2.44E-015)。这 7 个 SNP 位点中有6个是位于启动子区域。3、CYP19基因的(TTTA)n微卫星多态性中,其中单倍型(TTTA)11是PCOS患者中最常见的(0.354 vs 0.390)。而且PCOS患者多携带短重复片段的单倍型(0.47 vs.0.41,OR=1.245,95%CI:0.97～1.60)。4、AMH基因的rs10407022(Ile49Ser)和rs8112524的关联性分析中发现,TA单倍型可能和PCOS的发病有一定的相关性(P=0.013,OR=4.9906,95%CI=2.001～5.251)。结论:雄激素代谢通路中的一些关键酶基因如CYP11、CYP19以及相关基因AMH基因的多态性与PCOS疾病有一定的相关性,提示这些基因的突变可能引起雄激素水平的改变,从而影响着卵泡的发育及闭锁。第二部分 高雄激素动物模型的建立与卵泡生存能力的观察研究目的:通过建立高雄激素动物模型来观察研究雄激素信号通路对PCOS疾病的发生及卵泡生存能力的影响。方法:分别用不同雄激素如脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)、双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DTH)、睾酮(Testosterone,T)及丙酸睾酮(Testosterone propionate,TP)对小鼠及大鼠构建高雄激素动物模型。在mRNA及蛋白水平上分别检测3大类因子:1、雄激素代谢通路相关因子:CYP17、CYP19、AR及c-fos;2、卵泡发育因子:STAT3、P53、AR、FSHR及LHR;3、卵泡细胞间调节因子:GDF-9、BMP15、c-kit、SCF、HGF 等。结果:在四种雄激素造模的小鼠及大鼠模型中发现,DHEA造模的效果最好。在已成功造模的动物中,其卵巢整体卵泡状态呈现出类似临床PCOS患者的多囊样的改变,激素水平也和该患者很相似。Q-PCR结果显示雄激素代谢通路相关因子表达增强,卵泡生存能力增强,卵泡细胞间的调节因子表达增高。结论:雄激素能够通过增加卵泡细胞间的相互作用因子,从而引起卵泡的生存能力增强。也提示了 PCOS的发病病因可能与卵泡生存能力增强有关。第三部分 高雄激素对PtenloxP/loxP;GCre+小鼠卵泡发育及闭锁的干预研究目的:通过给予PtenloxP/loxP;GCre+小鼠雄激素干预治疗来探讨雄激素信号通路对卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)疾病的发生及卵泡生存能力的影响。方法:给予3周龄雌性PtenloxP/loxP;GCre+小鼠皮下包埋含有雄激素脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)的硅胶管。放置4周,正常每天记录其饮食及体重。在mRNA水平上检测卵巢的3大类因子:1、雄激素代谢通路相关因子:CYP17、CYP19、AR 及 c-fos;2、卵泡发育因子:STAT3、P53、AR、FSHR 及LHR;3、卵泡细胞间调节因子:GDF-9、BMP15、c-kit、SCF、HGF 等。结果:给予雄激素DHEA干预治疗后,我们发现PtenloxP/loxP;GCre+小鼠的卵巢中能够观察到始基卵泡、次级卵泡以及发育较好的窦卵泡。Q-PCR结果显示雄激素代谢通路相关因子表达增强,卵泡生存能力增强,卵泡细胞间的调节因子表达增高。并观察到此小鼠的繁殖生育能力有所改善。结论:雄激素能够通过增加卵泡细胞间的相互作用因子,从而引起卵泡的生存能力增强。一方面也提示了 PtenloxP/loxP;GCre+小鼠造成的POF的模型可能跟卵泡的生存能力减弱有关,而给予雄激素干预后可以通过提高卵泡生存能力而减慢卵泡的损耗从而对POF的治疗起到一定的帮助。