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慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia, CML)是起源于骨髓造血干细胞的恶性克隆性疾病，它以9号和22号染色体发生相互易位形成的BCR/ABL融合基因为发病特征，该基因编码的BCR/ABL癌蛋白具有高酪氨酸激酶活性，能够激活细胞内多条信号通路，从而使白血病细胞恶性增殖和凋亡受阻。CML分为慢性期，加速期和急变期，急变期由于其生存时间短，病死率高，缺乏有效的治疗策略而备受关注。β-catenin在CML急变过程中发挥着重要作用，而其受BCR/ABL及其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。在CML急变期细胞中，PI3K-AKT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有共同的靶基因c-myc和cyclinD1，他们共同调节白血病细胞的恶性增殖和抑制细胞凋亡。而GSK-3β作为它们的连接桥梁使我们推测这两条信号通路可能存在着交互作用。本课题的研究思路是首先检测β-catenin在CML慢性期和急变期的表达变化，以证实β-catenin在CML急变期高表达；其次采用PI3K-AKT信号通路的特异性抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞，检测其对K562细胞增殖和周期的影响；最后探讨PI3K-AKT信号通路对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，以明确LY294002抑制慢粒增殖的作用机制，为慢粒急变的发病机制及其靶向治疗提供新的思路。实验方法如下：1.采用定量PCR和Western blot检测临床CML病人慢性期和急变期中BCR/ABL和β-catenin表达变化。同时检测CML相关细胞株中β-catenin的蛋白表达情况。2.采用不同浓度的LY294002作用于K562细胞，MTT法检测其对K562细胞增殖的影响，克隆形成实验检测LY294002对细胞克隆形成能力的影响，流式细胞术检测LY294002对细胞周期的影响。3.采用20μM的LY294002处理K562细胞24h，Western blot检测pβ-catenin（S33/S37/T41）,总β-catenin, pGSK-3β(S9)的蛋白表达；定量PCR检测β-catenin的mRNA表达；免疫荧光和提取胞浆胞核蛋白检测β-catenin在胞浆胞核中的定位变化；放线菌酮联合处理检测β-catenin的蛋白稳定性；Western blot和qPCR检测Wnt/β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表达变化。通过以上实验，得到的实验结果如下：1.成功检测到CML急变期病人骨髓单个核细胞中BCR/ABL和β-catenin的mRNA和蛋白表达明显高于慢性期病人；检测到CML急变期细胞株K562、KU812中β-catenin的蛋白表达明显高于CML转化细胞株BP210、32DP以及BCR/ABL阴性细胞株BaF3、32D。2. MTT和细胞集落形成实验结果显示LY294002作用K562细胞24h后，抑制了K562细胞的增殖能力以及克隆形成能力，并且随着药物浓度的增加，抑制效应逐渐增强。流式细胞术发现LY294002能够抑制细胞周期进程，将K562细胞阻滞于G1期，G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞比例下降。3. Western blot发现LY294002处理K562细胞24h后，pβ-catenin（S33/S37/T41）,总β-catenin, pGSK-3β(S9)的蛋白表达减少；β-catenin的mRNA水平没有明显变化；β-catenin在胞浆和胞核中的定位同等程度地减少；β-catenin的蛋白稳定性下降；c-myc, cyclinD1的mRNA和蛋白表达减低。综上所述，实验结果证实CML中BCR/ABL和β-catenin的表达在急变期明显升高；PI3K-AKT抑制剂LY294002能够抑制CML急变期K562细胞的增殖及细胞周期，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。