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真核生物蛋白的合成需要大量的因子促进翻译起始、延伸和终止。翻译起始过程是翻译的关键限速步骤,需要很多翻译起始因子的参与。真核生物翻译起始因子eIF5B(eukaryotic Initiation Factor 5B)是从原核生物,古细菌到真核生物都保守的翻译起始因子之一(eIF1A和eIF5B),在翻译起始过程的最后一步发挥作用。酵母中eIF5B与氨酰tRNA互作,促进20S pre-rRNA的剪切,招募60S核糖体亚基形成完整的80S核糖体,进而起始翻译过程。然而,eIF5B基因在植物中的功能和作用机制还没有报道,本研究围绕拟南芥eIF5B基因开展相关研究并取得以下结果:1.通过筛选EMS诱变的拟南芥种子,获得一个热敏感的突变体hot3-1。采用图位克隆和测序的方法,发现该突变体是拟南芥翻译起始因子eIF5B基因(eIF5B-1;At1g76810)上一个单碱基突变产生的,进而导致第952位氨基酸由甘氨酸变成了丝氨酸。hot3-1突变体在正常生长条件下具有野生型(WT)的表型,但在热胁迫条件下成活率降低、下胚轴的伸长变短。通过核糖体谱分析发现热胁迫后hot3-1突变体中多聚核糖体形成较WT少,mRNA的翻译受到明显抑制。进一步通过对核糖体结合的mRNA进行高通量测序(RNA-Seq),在全基因组水平上分析了 hot3-1突变体中翻译效率改变的mRNA,发现一系列热胁迫相关基因的翻译在hot3-1突变体中被抑制,包括 ClpB3,ClpB4,CR88/HSP90.5,HSP17.6A 和 HSF7A 等。2.鉴定得到了一个eIF5B-1基因T-DNA插入突变体,hot3-2。该突变体在eIF5B-1蛋白的C端缺失了 30个氨基酸,导致植株发芽率降低,生长缓慢,叶片颜色变浅,荚长变短等多种生长发育表型的缺陷。对核糖体结合的mRNA进行RNA-Seq,发现该突变体中核糖体形成、线粒体呼吸链以及生长素相关的基因翻译效率降低,这些基因翻译效率的改变可能是导致hot3-2突变体表型缺陷的主要原因。此外,我们分析了翻译效率降低的基因的结构特点,发现它们的CDS长度相比翻译效率不变和翻译效率增加的基因较短,推测eIF5B-1的突变仅降低特定mRNA的翻译效率,而不是抑制整个翻译的过程。3.eIF5B-1 基因在拟南芥中存在三个同源基因,eIF5B-2(Atlg21160)、eIF5B-3(Atlg76720)和eIF5B-4(Atlg76820),它们具有相同的保守结构域,但对T-DNA插入突变体的分析表明没有一个基因可以替代eIF5B-1在生长发育和耐热性中的功能。其中eIF5B-2基因的表达模式与eIF5B-1基因不同而不能互补eIF5B-1的表型缺陷;另外两个基因eIF5B-3和eIF5B-4在进化上趋于无功能,eIF5B-3基因被ath-MIR2936剪切,而eIF5B-4基因由于在N端缺少一个碱基“A”而提前终止。