研究目的：肺癌是当今世界上严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,发病率在多数国家呈明显增高趋势,其中非小细胞肺癌大约占所有肺癌的75%～85%,5年平均生存率小于15%,多数患者死于放疗和化疗所带来的不良反应。因此,从天然化合物中寻找安全、有效的、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物的重要发展战略之一。沙蟾毒精是蟾酥中的主要活性成分之一,是C-17位含有一个吡喃酮环的C-24甾体类化合物,分子式为C24H32O6,分子量为416.511,具有广谱的抗肿瘤作用。近期研究表明,沙蟾毒精能抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导肝癌细胞的凋亡。然而,包括沙蟾毒精在内的C-24甾体类化合物一般都含有较窄的治疗窗和较高的毒性。药物动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律(ADME)的一门学科。药物在作用部位的浓度与药理作用的强度和持续时间直接相关。药物经过生物转化后,其相应的理化性质也会发生变化,从而引起药理及毒理活性的改变,通常代谢过程中药物极性增加,有利于生物体的排泄。了解药物在体内ADME过程,有利于进一步解析其药理与毒理作用。因此,本课题研究目的是探讨沙蟾毒精和其代谢产物1p-羟基-沙蟾毒精诱导肺癌细胞凋亡的作用及其药代动力学研究。研究内容分为三部分：第一部分是沙蟾毒精诱导肺癌A549细胞凋亡的研究。第二部分是沙蟾毒精在大鼠体内的生物转化及其产物1β-羟基-沙蟾毒精对肺癌A549细胞凋亡的研究。对大鼠体内沙蟾毒精的代谢物进行初步筛查,根据代谢物特征推测沙蟾毒精在大鼠体内的代谢途径。探讨1β-羟基-沙蟾毒精诱导肺癌A549细胞发生凋亡的机制以及其抑制PI3K/Akt信号转导途径。第三部分是沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精在大鼠体内药动学和组织分布研究。建立测定大鼠血浆及组织样品中沙蟾毒精和代谢物1 β-羟基-沙蟾毒精浓度的定量分析方法,对其的药代动力学和组织分布进行初步研究,阐明沙蟾毒精在大鼠体内的药代动力学过程和组织分布规律。研究方法：(1)MTT法测定沙蟾毒精对A549细胞抑制率,测定IC50值。采用倒置显微镜、Hochest33342染色实验观察沙蟾毒精处理A549细胞后所发生的形态学改变,检测“凋亡小体”；采用AnnexinV/PI双染色流式细胞法观测细胞凋亡比例。PI单染流式细胞术观察细胞周期的变化。(2)高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠尿液,胆汁和粪便中沙蟾毒精的浓度,研究沙蟾毒精在大鼠体内的排泄动力动力学特点。同时运用LC-MS分析技术和Lightsight计算机软件处理数据,初步推测沙蟾毒精在大鼠胆汁、尿液、粪便和血浆的代谢产物及其代谢通路。MTT法测定1β-羟基-沙蟾毒精对A549细胞抑制率,测定ICso值。采用倒置显微镜、Hochest33342观察1β-羟基-沙蟾毒精处理A549细胞后所发生的形态学改变；采用AnnexinV/PI双染色流式细胞法观测细胞凋亡。PI单染流式细胞术观察细胞周期的变化。PCR技术和Western Blot技术分别检测了A549细胞PI3K-Akt-mTOR信号通路、Bax、Bcl-2、 Caspase-3和Caspase-9基因和蛋白的变化。划痕试验和Transwell小室试验观察细胞的迁移和侵袭。(3)超快速液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆及组织中沙蟾毒精和1p-羟基-沙蟾毒精的浓度,研究沙蟾毒精在大鼠体内的药物动力学过程及组织分布特点,获得主要的药动学参数Tmax、Cmax、t1/2、MRT0-t、AUC0-t、AUC0-∞,阐明沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精组织分布规律。研究结果：(1)沙蟾毒精能够抑制非小细胞肺癌A549细胞生长,A549细胞经过沙蟾毒精处理后,细胞生长受到明显受抑制,增殖速度明显减弱,细胞相互分散,A549细胞出现了突起短缩,细胞逐渐由梭状变成椭圆形或圆形,体积变小、胞质皱缩减少,固缩且深染,折光性变差。细胞中可以见到很多空泡状改变现象,部分细胞脱离贴壁生长状态,成为悬浮细胞。且呈现剂量依赖性,其IC50值为431nM。Hoechst33342荧光染色实验可看到边集的细胞不断增加,细胞核高度固缩、凝聚,出现“凋亡小体”。G2/M期细胞百分率显著增加(F=71.54,P<0.001),G1期细胞百分率显著降低(F=25.99,P<0.001)。随着沙蟾毒精浓度的增加,G2/M期细胞所占比例明显增加,并且具有统计学意义。AnnexinV-PI双染结果显示沙蟾毒精可诱导A549细胞的凋亡,且随着沙蟾毒精浓度的增加A549细胞的凋亡率也相应的增加(F=111.1,P<0.001)。(2)①测定胆汁、尿液和粪便中的沙蟾毒精的线性范围为5.280-1056ng/mL(胆汁或尿液)和10.56-1056 ng/g(粪便),定量下限分别为5.280 ng/mL(胆汁或尿液)和10.56 ng/g(粪便)。胆汁、尿液和粪便日内精密度分别为4.8%～9.5%、7.1%～9.3%和7.1%～11.0%,日间精密度分别为5.7%～10.0%、3.9%～12.2%和5.1%～10.6%,准确度分别为-2.0%～1.6%、-2.1%～1.6%和-0.6%～4.3%。SD大鼠给药4.0mg/kg后,原形药物经胆汁、尿液和粪便途径24h累积排泄量占总给药量的百分比分别为：2.301%、19.67%和1.726%,三者的总排泄率为23.70%;三者的t1/2分别为1.66±0.07 h、2.54±0.78 h和5.8±1.22 h。在大鼠体内鉴定出沙蟾毒精的24种代谢物。其中胆汁中鉴定了17个代谢物,尿液中发现了16个代谢物,粪便中发现了10个代谢物,血浆中发现18个代谢物,包括I相代谢产物和Ⅱ相代谢产物,所涉及的代谢反应有：异构化、氧化、还原、甲基化、与硫酸结合、与葡萄糖醛酸结合。②A549细胞经用不同浓度1β-羟基-沙蟾毒精处理后,细胞生长受到了明显抑制,增殖速度明显减弱,细胞间相互分散,细胞逐渐由梭状变成椭圆形或圆形,体积变小、固缩且深染,折光性差。细胞透明度下降,细胞中出现了很多空泡状改变现象,部分细胞脱离贴壁生长状态,成为悬浮细胞。且呈剂量依赖性,其IC50值为208nM。Hoechst 33342染色实验可看到边集细胞不断增加,细胞核高度固缩、凝聚,出现了“凋亡小体”。PI单染结果显示,G2/M期细胞百分比显著增加(F=46.87,P<0.001),G1期细胞百分比显著降低(F=26.76,P<0.001)。随着1β-羟基-沙蟾毒精浓度的增加,G2/M期细胞所占比例明显增加,并且具有统计学意义。AnnexinV-PI双染结果显示1β-羟基-沙蟾毒精可诱导A549细胞的凋亡,且随着1 β-羟基-沙蟾毒精浓度的增加A549细胞的凋亡率也相应的增加(F=40.93,P<0.001)。Western Blot和PCR结果均表明,1β-羟基-沙蟾毒精可下调PI3K/Akt/m-TOR和Bcl-2的蛋白表达和mRNA水平；而上调Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平,由此来增加Bax/Bcl-2比值。划痕试验和Transwell小室试验表明,1β-羟基-沙蟾毒精能够显著降低549细胞的迁移率(F=78.86,P<0.001)和侵袭率(F=57.13,P<0.001),随着浓度的增大抑制作用增强。(3)健康SD大鼠腹腔注射给予低、中、高三个剂量沙蟾毒精后,血浆中沙蟾毒精的Tm。x分别为12.5±2.7 mmin、11.7±2.6 min和11.7±2.6min; Cmax分别为1078±182.6 ng/mL、1981±566.5 ng/mL和4373±1354 ng/mL；t1/2分别为103.8±40.43 min、113.0±47.02 min和110.3±21.17min; MRT0-t分别为：45.6+6.8min、38.6±9.6 min和42.7±10.5 min；用梯形法计算,AUC0-t分别为39.56±11.10mg·min/L、79.67±26.06 mg-min/L和166.7±57.96 mg·min/L; AUC0-∞分别为39.63±11.14 mg·min/L、79.78±26.11 mg·min/L和166.9±57.80 mg·min/L。血浆中的1β-羟基-沙蟾毒精Tmax分别为59.28±7.319min,47.5±6.124min, 47.50±6.124min; Cmax分.别为125.48±15.31 ng/mL,206.3±79.88 ng/mL, 390.1±111.3 ng/mL; t1/2分别为113.8±37.48 min,106.3±39.42 min,123.8±47.43 min; MRT0-t分别为98.21±22.34 min,85.75±18.29 min,95.88±11.94min;用梯形法计算,AUCO-t分别为7.192±2.142 mg-min/L,13.43±3.945 mg-min/L, 26.47±8.460 mg-min/L, AUC0-∞分别为7.271±2.187 mg-min/L,13.46±3.958 mg-min/L,26.67±8.542 mg-min/L。沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精的Cmax和AUC与给药剂量呈良好的相关性(P<0.05)。健康SD大鼠单剂量腹腔注射给药沙蟾毒精4.0 mg/kg后,沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精在心、肝、脾、肺、肾和脑等组织均有分布,沙蟾毒精在5.0 min或15 mmin时达到峰值,而1β-羟基-沙蟾毒精在45 min或60 min。给药15 min后,沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精主要分布于肾脏、肝脏和肺,表明肾脏和肝脏是其排泄和代谢的主要器官,同时肾脏、肝脏和肺脏也是其作用的靶器官。给药45 min后能在脑和睾丸中检出沙蟾毒精和1p-羟基-沙蟾毒精的含量,表明该药物能透过血脑和血睾屏障。结论：沙蟾毒精能抑制肺癌A549细胞的生长及诱导其发生凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期,呈剂量依赖性。排泄动力学结果表明沙蟾毒精其原型主要通过尿液途径排泄,随尿液、胆汁和粪便途径24 h累积排泄量占总给药量为23.43%。体内代谢研究表明,沙蟾毒精在大鼠体内的代谢主要是通过I相代谢的氧化反应和Ⅱ相代谢的与硫酸或葡萄糖醛酸结合的反应来完成,产生包括1β-羟基-沙蟾毒精在内的24种代谢产物。1β-羟基-沙蟾毒精能抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭。1β-羟基-沙蟾毒精能诱导肺癌A549细胞的凋亡,阻滞A549细胞周期于G2/M期。其诱导凋亡机制可能为：①抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,降低通路中相关蛋白的转录和翻译；②增加A549细胞内Bax/Bcl-2比值,促进凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的转录和翻译,从而促进肺癌细胞的凋亡,产生一定的抗肺癌作用。通过药物动力学研究,获得沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精在大鼠体内的主要药动学参数Tmax、Cmax、MRT0-t、AUC0-t和AUC0-∞等。Cmax和AUC0-∞与给药剂量呈良好的线性相关。沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精能迅速并广泛的分布于各个组织,肝脏、肾脏和肺是主要分布器官,且沙蟾毒精和1β-羟基-沙蟾毒精能透过血脑屏障和血睾屏障。