研究背景: 原发性肝癌的基因治疗是近年来的研究热点，但目前基因治疗临床疗效远不如动物实验和体外实验结果。造成这一区别的主要原因在于肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，单一因素的纠正往往不能达到理想的抑制肿瘤效应。旨在抑制肿瘤血管及增强机体肿瘤免疫的两种单一疗法的联合是增强基因治疗效果的新策略。B7-1作为共刺激因子对诱导产生肿瘤特异性CTL具有十分重要的作用。NK4是肝细胞生长因子(HGF)的拮抗剂及强有力的肿瘤血管牛成抑制剂。本研究拟将NK4基因及B7-1基因亚克隆至同一腺病毒载体，使之在诱导肿瘤细胞凋亡的同时激活产生更强的CTLs，从而发挥协同抗肿瘤效应，并为下一步利用该载体进行肝癌的复合基因治疗奠定基础。 方法: 1、双酶切pcDNA3/hNK4质粒获得NK4基因编码区序列及设计双引物PCR扩增获得B7-1基因编码区序列及CMV+PA片断后，通过亚克隆技术构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV/B7-1/(NV+PA/NK4。双酶切法及DNA测序鉴定重组载体的正确性。 2、利用基因重组技术构建含NK4及B7-1双基因的重组腺病毒质粒载体pAd-B7-1-NK4。酶切法将pAd-B7-1-NK4线性化，脂质体介导下将其转染包装细胞(HEK293细胞)，获得共表达人NK4及B7-1基因的重组包装病毒。PCR双引物法鉴定重组包装病毒是否带有NK4及B7-1基因编码区序列。 3、用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2，RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4及B7-1mRNA表达。 结果: 1、经酶切及DNA测序证实，NK4、B7-1基因编码区序列及CMV片断已准确无误定向插入pAdTrack-CMV穿梭载体中，成功构建了含NK4及B7-1双基因的重组穿梭质粒载体，并在两基因间插入了CMV+PA片断，形成双基因独立表达框。 2、将含独立表达框的NK4、B7-1基因编码区序列亚克隆至E1和E3缺失的腺病毒基因组载体中(pAdEasyl)，获得共表达人NK4及B7-1基因的重组腺病毒质粒载体(pAd-B7-1-NK4)。脂质体介导下将PacI线性化的pAd-B7-1-NK4转染至包装细胞，获得共表达人NK4及B7-1基因的重组包装病毒，PCR双引物法鉴定表明成功构建带有NK4及B7-1基因编码区序列的缺陷型重组包装病毒。 3、制备的pAd-B7-1-NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4、B7-1双基因同时高水平表达。 结论: 1、成功构建了含NK4基因、B7-1基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为利用其进一步开展肿瘤的复合基因治疗奠定基础。 2、成功在两基因问插入了CMV+PA片断，形成双基因独立表达框，这样两个基因将各自转录及翻译，避免了形成融合蛋白。