【摘 要】
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目的:课题组前期实验发现骨形态发生蛋白9(BMP9)在诱导小鼠永生化根尖牙乳头干细胞(iSCAP)向成骨/成牙本质方向分化方面能力较强,但目前对于相关分子学机制的研究较少。研究
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目的:课题组前期实验发现骨形态发生蛋白9(BMP9)在诱导小鼠永生化根尖牙乳头干细胞(iSCAP)向成骨/成牙本质方向分化方面能力较强,但目前对于相关分子学机制的研究较少。研究发现,Smad信号通路属于BMP信号传导系统中的经典通路。因此,本课题主要是研究BMP9是否能够激活iSCAP细胞中的Smad信号通路,以及Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP细胞成骨/成牙本质向分化中的作用。方法:首先,用Ad-BMP9转染iSCAP,36h后采用Western免疫印迹实验检测Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。随后,用显性负性突变受体ALK1(dnALK1)重组腺病毒和BMP9条件培养基共同作用于iSCAP,通过Western免疫印迹实验检测Smad1/5/8蛋白磷酸化水平;然后,分别采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和染色方法分析iSCAP早期成骨/成牙本质指标变化,Western印迹实验检测中晚期成骨/成牙本质相关蛋白OCN、OPN表达,茜素红染色法检测钙盐沉积程度;最后,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测dn ALK1对BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表达的影响。结果:BMP9可上调iSCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平;dnALK1竞争性抑制BMP9条件培养基的作用后,Smad1/5/8的磷酸化水平下调,BMP9诱导的iSCAP细胞中早期成骨/成牙本质标志物碱性磷酸酶活性下降,中晚期成骨/成牙本质相关蛋白OCN、OPN表达减少,晚期成骨/成牙本质标志钙盐结节减少。RT-PCR结果显示重要成骨转录因子Runx2基因表达减少,成骨/成牙本质相关基因OCN、OPN、DMP1的表达也受到了抑制。结论:Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质过程中存在并起着重要作用。ALK1是BMP9-Smad信号通路中的重要受体,dnALK1能有效拮抗BMP9蛋白的活性,但是否同样抑制其他信号通路还需要进一步研究,后续我们将通过体内动物实验来进一步验证dnALK1对BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质过程的抑制作用。
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