本研究首先研究饲粮汞污染(以氯化汞的形式添加)对蛋鸡生产性能,蛋品质,主要组织器官损伤,卵泡闭锁率和血清激素水平的影响,同时探讨饲粮汞污染对蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢抗氧化系统的影响以及研究其相关分子机制。在体内试验基础上,体外分别构建蛋鸡卵巢颗粒细胞模型和鸡胚肾细胞模型,进一步研究氯化汞处理对蛋鸡孕酮激素分泌的影响分子机制和氯化汞诱导鸡胚肾细胞内质网应激相关PERK-ATF4-CHOP信号通路参与的细胞凋亡分子机制。主要研究内容和结果如下:1饲粮汞污染对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响本试验旨在研究饲粮汞污染对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响。选取健康且体重相近的40周龄海兰褐蛋鸡768只,随机分成4个处理组,每组8个重复,每个重复24只鸡。4个处理组饲粮中汞含量分别为0.28,3.33,9.42,27.24 mg/kg。试验周期为10周,包括1周预饲期和9周正式期。结果表明,饲粮汞污染可以显著降低蛋鸡产蛋率(P<0.05)和平均蛋重(P<0.05),反而显著提高料蛋比(P<0.05),同时对蛋鸡平均采食量和死淘率无显著影响(P>0.05)。饲粮汞污染还可以显著降低哈氏单位(P<0.05),蛋白高度(P<0.05),蛋壳强度(P<0.05)和蛋壳厚度(P<0.05),而对蛋黄颜色无显著影响(P>0.05)。另外,3.33,9.42和27.24mg/kg汞处理组的蛋黄、蛋白、蛋壳和全蛋中汞沉积量均显著高于0.28 mg/kg汞处理组(P<0.05)。哈氏单位(P<0.05)和蛋白高度(P<0.01)与蛋白、蛋黄和全蛋中汞沉积量均呈显著性负相关关系。蛋壳强度(P<0.05)和蛋壳厚度(P<0.05)与蛋壳和全蛋中汞沉积量亦均呈显著性负相关关系。2饲粮汞污染对蛋鸡肝脏、肾脏损伤和卵泡闭锁率的影响本试验旨在研究饲粮汞污染对蛋鸡肝脏和肾脏器官损伤,以及对卵泡闭锁率的影响。结果表明,饲粮汞污染会造成汞在蛋鸡心脏、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、卵巢、肌胃和腺胃内沉积,同时随着饲粮中汞水平增加,汞沉积量显著提高(P<0.05)。在相同处理组中,汞在肾脏中沉积量最高,肝脏和卵巢中次之。饲粮中汞污染还会造成蛋鸡肝脏和肾脏的组织不同程度损伤。此外,27.24 mg/kg汞处理组的血清中谷丙转氨酶(GPT)(P<0.05)和血清球蛋白(GLB)(P<0.05)水平均显著高于0.28和3.33mg/kg汞处理组。同时,27.24mg/kg汞处理组的血清中谷草转氨酶(GOT)水平显著高于其余各处理组(P<0.05)。然而,与0.28 mg/kg汞处理组相比,27.24mg/kg汞处理组的血清中白蛋白(ALB)水平和ALB/GLB均显著降低(P<0.05)。此外,3.33,9.42和27.24 mg/kg汞处理组的血清中尿素氮(BUN)(P<0.05),肌酐(CRE)(P<0.05)和水平尿酸(UA)(P<0.05)水平均显著高于0.28 mg/kg汞处理组。另外,饲粮汞污染会显著提高蛋鸡卵泡闭锁率(P<0.05),并且卵巢中汞的沉积量与卵泡闭锁率呈显著的正相关关系(P><0.01)。3饲粮汞污染对蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢抗氧化系统的影响本试验旨在研究饲粮汞污染对蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢抗氧化系统的影响。结果表明,饲粮汞污染可以显著降低蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢中超氧化物歧化酶(SOD)(P<0.05)、过氧化氢酶(CAT)(P<0.05)、谷胱甘肽还原酶(GR)(P<0.05)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力(P<0.05),以及谷胱甘肽(GSH)水平(P<0.05)。然而,蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢中丙二醛(MDA)水平均显著升高(P<0.05)。同时,饲粮汞污染可以显著降低蛋鸡肝脏中铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)(P<0.05)、CAT(P<0.05)、GR(P<0.05)和GSH-Px(P<0.05)基因表达水平,以及蛋鸡肾脏和卵巢中铜锌超氧化物歧化酶CuZnSOD(P<0.05)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)(P<0.05)、CAT(P<0.05)、GR(P<0.05)和GSH-Px(P<0.05)基因表达水平。饲粮汞污染还可以显著降低蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢中转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)基因和蛋白表达(P<0.05),反而显著提高其中胞质接头蛋白(Keapl)基因和蛋白表达(P<0.05)。此外,除了肝脏中锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因以外,其他的抗氧化酶活力与抗氧化酶基因表达之间均呈现显著正相关关系(P<0.05)。蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢中Nrf2基因表达与抗氧化酶基因表达之间亦呈显著正相关(P<0.05),而Nrf2基因、蛋白表达与Keapl之间均呈显著负相关(P<0.01)。4汞处理对蛋鸡孕酮激素分泌的影响研究本试验旨在研究氯化汞处理对蛋鸡卵巢孕酮(P4)激素分泌的影响研究。体内试验结果表明,饲粮汞污染可以显著降低卵泡刺激素(FSH)(P<0.05)、黄体生成素(LH)(P<0.05)和P4激素(P<0.05)水平。体外培养卵泡颗粒细胞研究不同汞剂量、不同处理时间对类固醇激素合成酶(StAR)、侧链裂解酶(P450scc)和类固醇脱氢酶(3β-HSD),以及环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路的影响,进一步探讨氯化汞处理对蛋鸡P4激素水平影响的分子机制。体外试验结果表明,与对照组相比,2、4和6 μM汞处理会显著降低12 h的P4激素水平(P<0.05),且4和6uM汞处理会显著降低48 h的P4激素水平(P<0.05)。与对照组相比,2、4和6μM汞处理会显著降低12和24h的环磷酸腺苷(cAMP)水平(P<0.05)和24h的蛋白激酶A(PKA)水平(P<0.05)。同时,与对照组相比,6μM汞处理会显著降低48 h的cAMP水平(P<0.05),以及12和48 h的PKA水平(P<0.05)。此外,与对照组相比,2、4和6 μM汞处理还会显著降低24和48 h类固醇激素合成调节蛋白(StAR)(P<0.05)、细胞色素P450侧链裂解酶(P450scc)(P<0.05)和类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因表达水平(P<0.05)。通过各指标间相关性分析结果表明,在12和24h培养时间,卵巢颗粒细胞内P4、cAMP、PKA、StAR、P450scc和3β-HSD水平之间均呈现显著正相关关系(P<0.05)。5汞处理对鸡胚肾细胞凋亡的影响研究本试验旨在研究氯化汞处理对鸡胚肾脏(CEK)细胞凋亡的影响。体内试验结果表明,9.42和27.24 mg/kg汞处理组蛋鸡的肾脏组织中均出现了不同程度的细胞凋亡。之后进行体外试验进一步研究氯化汞诱导蛋鸡肾脏发生细胞凋亡的分子机理。体外培养CEK细胞,设置4个处理组:对照组(0μM汞),5 μM汞处理组、10 μM汞处理组和15 μM汞处理组。同时,应用内质网应激(ERS)抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理细胞探索ERS在氯化汞诱导CEK细胞凋亡过程中所起作用,另外设置4个处理组:对照组(0λM汞),4-PBA处理组,15μM汞处理组和15μM汞+4-PBA处理组。试验结果表明,与对照组相比,氯化汞处理会降低CEK细胞培养24h后的致密程度,还会显著增加细胞核浓缩程度,并且显著降低CEK细胞活力(P<0.05)。与对照组相比,氯化汞处理可以显著增加CEK细胞凋亡率(P<0.05),显著增加CEK细胞线粒体膜电位降低百分比(P<0.05),并且显著增加Bax/Bcl-2基因表达(P<0.05)。然而,当4-PBA与15μM汞共同处理CEK细胞后,CEK细胞活力显著高于15 μM汞处理组(P<0.05);CEK细胞凋亡率会显著低于15μM汞处理组(P<0.05);细胞内Bax/Bcl-2基因表达显著低于15μM汞处理组(P<0.05)。此外,与对照组相比,氯化汞处理可以显著提高CEK细胞内GRP78(P<0.05)、ATF4(P<0.05)和CHOP(P<0.05)基因表达和显著提高GRP78(P<0.05)、ATF4(P<0.05)、p-PERK/PERK(P<0.05)和CHOP(P<0.05)蛋白表达。然而,当4-PBA与15μM汞共同处理CEK细胞后,CEK细胞内GRP78(P<0.05)、ATF4(P<0.05)、CHOP(P<0.05)基因表达水平和GRP78(P<0.05)、ATF4(P<0.05)、p-PERK/PERK(P<0.05)和CHOP(P<0.05)蛋白表达水平均显著低于15μM汞处理组。以上结果提示:饲粮汞污染显著降低蛋鸡生产性能和蛋品质,造成蛋鸡肝脏和肾脏组织结构损伤,并显著提高卵泡闭锁率。饲粮汞污染可以通过抑制Nrf2-Keap1通路抑制下游的抗氧化酶基因表达,显著降低蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢中抗氧化酶活力,从而损伤蛋鸡肝脏、肾脏和卵巢的抗氧化系统。此外,饲粮汞污染会显著降低血清中FSH、LH和P4水平。体外试验研究发现,氯化汞可以在时间和剂量依赖下干扰蛋鸡卵巢颗粒细胞内cAMP-PKA通路和StAR、P450scc和3β-HSD关键基因的表达,从而抑制细胞内P4激素的分泌。此外,饲粮汞污染可以诱导蛋鸡肾脏发生细胞凋亡。体外试验研究发现,氯化汞处理会通过激活CEK细胞内ERS相关的PERK-ATF4-CHOP通路,CHOP因子会增强线粒体中Bax/Bcl-2基因表达来诱导CEK细胞凋亡。