研究背景：随着人们生活方式的转变,高脂血症的患病率逐年增高,据统计,在我国≥20岁人群中,高胆固醇血症的患病率为9.0%,临界性高胆固醇血症的患病率为22.5%。甲状腺功能异常经常伴随有血脂水平的紊乱,传统理论认为甲状腺功能异常时胆固醇水平的改变是甲状腺激素作用结果,如甲状腺功能减退(甲状腺激素降低,促甲状腺素(thyrotropin, TSH)升高)常合并有高胆固醇血症,而甲状腺功能亢进(甲状腺激素升高,TSH降低)则常伴有血胆固醇浓度的降低。越来越多的临床研究证实血清TSH与胆固醇水平正相关。肝脏是人体进行胆固醇代谢最重要的器官。我们的前期研究证实肝细胞表面有功能性的TSH受体表达,并且TSH可以通过cAMP/PKA/CREB途径上调肝脏胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶的表达,从而增加胆固醇的合成。肝脏胆固醇代谢除胆固醇合成外,还包括很重要的一个方面——胆固醇的转化。胆固醇转化为胆汁酸是体内清除过多胆固醇的主要方式,体内约50%的胆固醇通过胆汁酸合成代谢排出体外。我们前期的研究证实TSH升高肝脏细胞内胆固醇的含量升高,那么TSH在增加胆固醇合成的同时,是否对胆固醇的转化也有影响呢?目前国内外尚未见报道。关于甲状腺功能对胆汁酸影响的研究甚少。PAULETZKI发现与甲状腺功能正常人群相比甲亢患者胆酸(cholic acid, CA)合成速率减少34%(5.8±2.8 vs7.9±4.2,P<0.02),胆汁酸中CA/CDCA比值降低(0.57±0.13 vs 1.19±0.32,P<0.01)。而Kosuge发现相对于正常人血清,甲亢患者总胆汁酸增加,而甲减降低,虽然无统计学意义但有变化的趋势；该研究也发现甲状腺功能异常时胆汁酸的成分发生了变化,甲减患者DCA+CA/LCA+CDCA的值增高(1.45±0.42 vs 0.95±0.48,P<0.01),甲亢患者该比值降低(0.50±0.19 vs 0.95±0.48,P<0.05)。这两项研究均提示甲状腺疾病中TSH和／或甲状腺激素变化与胆汁酸水平及其成分相关。胆固醇7a-羟化酶(CYP7A1)是胆汁酸合成经典途径的限速酶。TiangangLi研究发现过表达CYP7A1的小鼠胆囊中胆汁的主要成分由胆酸(57%)转变为鹅脱氧胆酸(54%),提示甲状腺功能异常时胆汁酸成分的改变可能是由CYP7A1活性的改变引起的。Sauter报道引起甲亢和甲减患者胆汁酸变化的原因可以排除甲状腺激素的作用,进一步提示TSH极有可能通过CYP7A1调节胆汁酸代谢。本研究拟通过体外和体内实验研究集中论证TSH通过肝脏TSHR调控胆固醇转化的信号转导机制,阐明其病理生理学分子特征,建立TSH调控胆固醇转化的分子信号网络,为认识TSH与肝脏胆固醇转化之间的生物学功能联系和探究甲状腺疾病胆固醇代谢异常的发生机制提供证据和新思路。研究目的：阐明TSH在肝脏对胆固醇分解限速酶CYP7A1的影响以及其作用机制,进一步揭示TSH对胆固醇代谢的调节作用,完善甲状腺疾病时胆固醇代谢异常的发生机制。研究方法：1.在体外实验,用牛TSH处理肝细胞,检测细胞CYP7A1表达。用无血清培养基培养人HepG2细胞,不同浓度TSH刺激HepG2细胞不同时间,观察TSH与细胞CYP7A1表达及胆汁酸含量的量效和时效关系。。2.为了进一步研究TSH与胆固醇转化之间的关系,我们通过手术切除大鼠甲状腺建立了甲减大鼠模型。该模型突出优点是可根据需要人工控制体内甲状腺激素和TSH水平。不但能排出甲状腺激素的效应,而且能准确地评价外源性TSH对大鼠胆固醇代谢的影响。术后血清TT4≤1 .41ng/ml确认为完全切除甲状腺切除大鼠甲状腺,共获得手术摘除甲状腺组大鼠48只,同时设假手术组(30只)作为对照。3.为表明TSH影响肝细胞CYP7A1的表达是通过TSHR作用的,我们建立的TSHR敲除小鼠模型,由于TSHR的缺失,TSHR敲除小鼠表现为严重的甲减,为了排除甲状腺激素的影响,我们在小鼠饲料中添加甲状腺激素,以维持小鼠正常的甲状腺激素水平,观察TSHR敲除小鼠与野生型小鼠胆汁酸代谢相关指标的变化。另外,我们采用慢病毒包被的shRNA转染HepG2细胞,抑制TSHR表达,检测TSH刺激后CYP7A1的表达及胆汁酸含量的变化。4.检测TSHR受体基因敲除小鼠肝脏CYP7A1主要调节因子的变化,筛选在TSH调节CYP7A1表达过程中可能发挥作用的调控因子5.为了证实TSH抑制肝细胞CYP7A1 mRNA表达是通过抑制HNF-4α与CYP7A1启动子区的结合能力实现的,本研究设计相应的包含有HNF-4α结合位点(HNF-4 α-RE)的CYP7A1启动子的一个DNA片段以及其相应的突变对照DNA片段,与荧光素酶基因融合,构建荧光素酶报告基因,然后转染到HepG2细胞。在不同处理条件下,测定荧光素酶活性。6.为了探讨TSH对CYP7A1表达的影响是否通过cAMP/PKA信号系统,我们应用PKA抑制剂H89和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预孵肝细胞,再用TSH刺激肝细胞,检测cAMP和CYP7A1变化。7.研究发现阻断cAMP/PKA通路并不能完全消除TSH对CYP7A1的影响,我们进一步探讨PI3K/Akt信号通路的作用。我们应用PI3K抑制剂LY294002预孵肝细胞,再用TSH刺激肝细胞,检测Akt通路相关指标和CYP7A1变化,并进一步探讨TSH通过PI3K/Akt通路调节CYP7A1的具体机制。研究结果：1.TSH在体内与体外均可抑制肝细胞CYP7A1的表达和活性(1)不同浓度bTSH对CYP7A1蛋白的影响与正常对照组比,用1 μM和4μM bTSH分别处理细胞后,CYP7A1蛋白表达分别下降了23%和52%,差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。说明bTSH可剂量依赖性地下调CYP7A1蛋白水平。(2)不同浓度bTSH刺激对CYP7A1 mRNA水平的影响与正常对照组相比,CYP7A1的mRNA表达分别下降了33%和61%,差异有统计学意义(p<0.01)。说明bTSH可剂量依赖性地下调CYP7A1 mRNA水平。(3)雄性Wistar大鼠分别进行甲状腺摘除术(Tx)或假手术。Tx大鼠给予注射T4和不同剂量的bTSH。在每天注射外源性T4后,与假手术组比,Tx大鼠血清T4水平并无显著差异(p>0.05)。但是,与仅注射T4的大鼠相比,Tx同时注射外源性TSH和T4会显著增加血清TSH水平,Tx大鼠补充TSH后,血清TC水平升高,同时血清和肝脏中TBAs水平下降,呈量效关系。作为BAs合成限速酶的CYP7A1蛋白水平和活性在补充TSH后也呈剂量依赖性下降。2.TSH由TSHR介导抑制CYP7A1表达减少胆汁酸合成(1)TSHR敲除小鼠肝脏CYP7A1以及胆汁酸含量的变化：与野生型小鼠相比,TSHR受体敲除小鼠在补充甲状腺激素后,血清甲状腺激素水平无明显差异,血清总胆汁酸,胆汁酸池,肝脏胆汁酸含量,胆囊胆固醇含量以及粪便胆汁酸排泄率均增加,而相应的CYP7A1蛋白及mRNA水平也显著增加。(2)慢病毒介导的TSH受体RNA干扰：TSHR-RNAi-lentivirus转染HepG2细胞可以显著降低肝细胞TSHR的表达,而TSH对肝细胞CYP7A1表达以及胆汁酸含量的抑制作用消失。(3)尾静脉注射TSHR-SiRNA对小鼠肝脏CYP7A1以及胆汁酸含量的变化：与注射PBS组小鼠相比,尾静脉高压动力注射TSHR-siRNA可以显著抑制肝脏TSHR的表达,而对甲状腺功能没有影响,肝脏CYP7A1的表达以及血清总胆汁酸水平显著增加。3.TSH通过HNF-4a调控CYP7A1表达(1)与野生型小鼠相比,TSHR受体敲除小鼠FXR,LRH-1,PXR, FGFR4,β-Klotho等分子的mRAN水平均无明显变化。(2)HNF-4a是肝脏内含量最丰富的核受体,其已被证实在CYP7A1的调控中发挥重要作用,我们发现与野生型小鼠相比,TSHR受体敲除小鼠HNF-4 a mRNA水平明显增加。(3)报告基因结果：HepG2细胞转染包含有HNF-4 a结合位点的CYP7A1启动子区的DNA片段的报告基因质粒,再用TSH刺激,可以显著降低细胞的荧光素酶活性,而当把HNF-4a结合位点突变之后,TSH对荧光素酶活性的抑制效应消失,说明TSH确实通过影响HNF-4 a与CYP7A1启动子区的结合调节CYP7A1的表达。4、TSH通过cAMP/PKA信号通路增加HNF-4 a磷酸化(1)我们前期研究发现TSH通过TSHR增加cAMP的产量,而有研究发现cAMP通过PKA通路增加HNF-4 a磷酸化从而抑制HNF-4 a与CYP7A1启动子区的结合。我们研究发现TSH刺激可引起HepG2 HNF-4a磷酸化明显增加。(2)我们应用PKA抑制剂H89或者腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536)处理肝细胞,发现其都仅能够部分而非完全逆转TSH对CYP7A1的抑制作用,表明除了cAMP/PKA信号通路外还有其他通路在TSH介导的抑制CYP7A1机制中发挥作用。5、TSH通过PI3K/Akt/SREBP-2通路抑制核内HNF-4a的表达(1)TSH处理HepG2细胞可剂量依赖性的增加p-Akt水平。(2)应用PI3K抑制剂LY294002处理HepG2细胞可以显著消除TSH对肝脏HNF-4a以及CYP7A1的影响。(3)TSH可通过PI3K/Akt通路剂量依赖性的增加HepG2细胞SREBP-2的表达：TSH处理HepG2细胞可剂量依赖性的增加SREBP-2蛋白的表达,应用P13K抑制剂LY294002预处理处理HepG2细胞后TSH对SREBP-2的效应消失。(4)SREBP-2对HNF-4 a与CYP7A1的调节作用：HepG2细胞共转染包含有HNF-4α结合位点的CYP7A1启动子区的DNA片段的报告基因质粒以及SREBP-2过表达质粒,可以显著降低细胞的荧光素酶活性,而共转染HNF-4 a结合位点突变质粒以及SREBP-2过表达质粒,细胞的荧光素酶活性无明显变化,说明SREBP-2可以调节HNF-4 a与CYP7A1的结合。(5)TSH通过PI3K/Akt/SREBP-2通路调节HNF-4 a:应用SREBP-2 siNRA转染HepG2细胞显著抑制SREBP-2蛋白表达,再用TSH刺激,TSH对HNF-4 a和CYP7A1的抑制作用得到一定程度的恢复。结论：1、本研究通过体外细胞实验和体内实验研究,证明了TSH可以抑制肝脏胆固醇转化的限速酶CYP7A1的表达,并且通过一系列实验论证了其具体机制,发现TSH可通过cAMP/PKA通路增加HNF-4a的磷酸化,通过PI3K/Akt/SREBP-2通路抑制核内HNF-4 a的表达,两条通路共同作用导致CYP7A1表达下降,胆汁酸合成的减少,从而使细胞内胆固醇含量增加。2、我们的研究阐明了TSH与肝脏胆固醇转化间的生物学功能联系,为探究甲状腺疾病胆固醇代谢异常的发生机制提供新的思路,为纠正胆固醇代谢紊乱提供新的治疗靶点和策略。