论文部分内容阅读
研究背景:唾液酸(sialic acid,Sia)是一类天然糖酸类化合物,广泛存在于生物体内。目前已确定的唾液酸有50多种天然衍生物,其中较为常见的三种衍生物分别是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(KDN)。唾液酸常以短链残基的形式存在于糖蛋白、糖脂等糖复合物的末端,例如可以通过α-2,3,α-2,6,α-2,8糖苷键分别与半乳糖(Gal),N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以及其他唾液酸相连接。细胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化在许多生理过程中起重要作用,作为一种生物信息传递分子,唾液酸参与细胞粘附、抗原识别和信号传导等诸多生理过程。另外,肿瘤的浸润和转移也与细胞膜上唾液酸的表达有密切关联。人类辅助生殖技术(assisted reproducti ve technology,ART)是指通过医疗辅助手段协助不孕不育夫妇受孕的方法。目前辅助生殖技术已成为治疗不孕不育的重要辅助手段。但是,人工操作配子、合子以及胚胎在一定程度上可能会对胚胎造成损伤。近年来,许多研究表明,ART可导致妊娠期并发症,早产,以及低体重儿等不良妊娠结局的发生率增加。因此,对ART安全性的研究已成为临床生殖医学研究的热点。但目前尚未有关于唾液酸和辅助生殖妊娠的相关研究。本研究以人类IVF-ET(体外受精-胚胎移植)来源胎盘和自然妊娠来源胎盘作为研究对象,通过RNA-seq,Western Blot,Realtime-PCR,ELISA等技术从基因和蛋白质水平对不同来源的胎盘进行研究,目的在于发现ART和自然妊娠来源胎盘中的基因表达差异。同时,结合多聚唾液酸及其载体蛋白的表达,以胎盘滋养层细胞的侵袭可能与其相关为切入点,检测唾液酸和相应载体的表达差异,以此了解ART对胎盘发育的影响,进而推测胎儿宫内环境的潜在变化,进一步确保优生优育和ART更好的发展。研究目的:1.ART技术是否会造成胚胎基因水平的变化;2.证明胎盘中多聚唾液酸的存在并明确其载体蛋白的种类;3.通过对不同妊娠方式和妊娠结局的孕妇胎盘进行多聚唾液酸及其相关基因和蛋白的检测,分析其在不同组别中的表达变化;4.不同妊娠方式对胎儿体重/胎盘比值的影响;5.探究多聚唾液酸及其相关基因和蛋白的表达水平与自然妊娠GDM(妊娠期糖尿病)孕妇血糖的相关性。研究方法:(1)2018年9月～2019年3月我们招募了在厦门大学附属成功医院分娩的孕妇,其中辅助生殖技术妊娠孕妇(ART组)为研究组,自然妊娠孕妇(NC组)为对照组;随着后续研究的进行,根据孕妇是否患有妊娠期糖尿病(GDM),又将ART组分为健康组(A组)和患病组(A GDM组),NC组分为健康组(N组)和患病组(NGDM组)。本次研究共收集52例ART来源胎盘和60例自然妊娠来源胎盘,以一般资料调查法调查母婴的基本情况和妊娠结局;利用RNA-seq比较不同妊娠方式和妊娠结局造成的基因表达变化;通过western blot证明胎盘中多聚唾液酸的存在并明确其载体蛋白,同时比较不同组间多聚唾液酸的表达差异;利用Realtime PCR,Western Blot,ELISA L比较NRP2,CADM1,ST8siaIV在不同组间基因和蛋白水平的表达差异,同时将相关数据与血糖水平进行相关性分析。研究结果:(1)对比健康ART组(A组)和健康自然妊娠组(N组)孕妇胎盘,其基因表达确实存在差异,在A组与N组之间我们筛选出了1051个具有统计学意义的差异基因,其中A组较N组上调基因有382个,下调基因有669个。ART孕妇中不同妊娠结局之间胎盘基因表达也存在差异,在AG组与A组之间我们共筛选出681个差异基因,其中AG组较A组上调基因有310个,下调基因有371个。A组与N组相比,A组与细胞内蛋白代谢,转录过程以及核糖体结构组成相关的基因显著上调;调控细胞生长,胰岛素样生长因子合成,与生长因子结合以及调控细胞内组分合成的基因发生显著下调。AG和A组相比,在生物过程、细胞组分和分子功能方面没有发生显著的差异性变化。A组与N组相比,发生上调的基因在与核糖体亚基形成所在的通路中显著富集;发生下调的基因在金黄色葡萄球菌感染,原发性免疫缺陷,移植物抗宿主病,补体途径等免疫系统相关的通路中显著富集。ART组不同妊娠结局的胎盘之间,即AG组与A组相比,差异基因在核糖体形成通路中富集较为显著,其它通路中的富集显著性较低。(2)胎盘组织中存在多聚唾液酸,其载体蛋白主要是NRP2和CADM1,而不是常见的NCAM载体;胎盘中多聚唾液酸以N-连接形式与载体蛋白结合。(3)ART组NRP2在基因和蛋白表达水平上均高于NC组(P<0.05)。分为四组后,在基因和蛋白水平上,A组NRP2表达水平均高于N组胎盘,但无统计学意义。(4)ART组CADM1在基因表达水平上高于NC组(P<0.05),在蛋白表达水平上两组间无差异;分为四组后,在基因水平上,A组CADM1表达与N组无差异,A GDM组CADM1表达高于N GDM组(P<0.05);在蛋白水平上,A组CADM1表达与N组无差异。(5)ART组ST8siaⅣ在基因和蛋白表达水平上均高于NC组(P<0.05)。分为四组后,在基因水平上,A组ST8siaⅣ表达略高于N组,但无统计学意义;A GDM组ST8siaⅣ表达高于N GDM组(P<0.05);在蛋白水平上,A组ST8siaⅣ表达高于N组(P<0.05)。(6)ART组多聚唾液酸表达水平高于NC组(P<0.05),分为四组后,A组多聚唾液酸表达高于N组(P<0.05)。(7)ART组胎盘重量高于NC组(P<0.05),胎儿重量在两组间无差异,ART组胎儿/胎盘比值低于NC组(P<0.05)。(8)CADM1,ST8siaⅣ在基因和蛋白表达水平上都与孕妇血糖呈正相关(P<0.05),多聚唾液酸表达水平与孕妇血糖呈负相关(P<0.05)。结论:辅助生殖妊娠技术对胚胎的操作确实会导致胚胎基因水平上的变化。不同妊娠结局的胎盘中基因表达也存在差异。ART组胎盘中多聚唾液酸表达高于NC组胎盘,ART组NRP2载体与ST8siaⅣ在基因和蛋白表达水平上都高于NC组,ART组CADM1载体在基因表达水平上高于NC组,蛋白表达水平上两组无差异。ART组胎盘重量高于NC组,胎儿重量在两组间无差异,ART组胎儿/胎盘比值低于NC组。多聚唾液酸表达越高,孕妇血糖越低;CADM1基因和蛋白表达水平越高,孕妇血糖越高;ST8siaⅣ基因和蛋白表达水平越高,孕妇血糖越高。