目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤,仍是全世界癌症相关死亡的最主要原因。原癌基因活化与抑癌基因的失活对肺癌的恶性生物学行为有关键性作用。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）的发生、发展以及侵袭转移的恶性行为不仅与肺癌细胞自身特性有关,与肿瘤免疫微环境的关系也十分密切。肺癌目前以手术、放疗、化疗和分子靶向治疗为主的综合治疗为主要治疗手段,尽管靶向EGFR和ALK等通路的分子靶向药物在肺癌治疗中取得显著进展,但对于肺鳞癌和野生型肺腺癌患者的治疗却迟迟没有突破性进展,晚期肺癌患者中位生存时间仍然只有1年左右。因此,找到新的治疗方法是目前亟待解决的问题。近年来,免疫检测点治疗在多种恶性肿瘤治疗中获得显著临床疗效,在肺癌治疗中,PD-1抗体药物已获批用于非小细胞肺癌一/二线治疗,为无法应用酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）治疗的野生型非小细胞肺癌患者带来了新生。虽然PD-1/PD-L1通路是PD-1抗体药物治疗靶点,但肿瘤PD-L1表达作为疗效预测因子并不精准,部分肿瘤PD-L1表达阴性的患者仍能从PD-1/PD-L1抗体治疗中获益。这与PD-1/PD-L1通路所处肿瘤微环境的复杂性有关。除了肿瘤细胞外,PD-L1也表达于肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中活化的免疫细胞,包括T细胞,自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK）,巨噬细胞等。另外,肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocyte,TIL）数量多少及微环境中其他免疫细胞分布,比如髓源性抑制细胞,巨噬细胞等,共同影响患者免疫状态及预后。目前,基于肿瘤细胞PD-L1表达和肿瘤组织浸润淋巴细胞数量将肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment,TIME）分为四种类型,这四种亚型包括:I型:肿瘤PD-L1表达阳性并且TILs浸润,此类患者处于适应性免疫抑制状态,肿瘤表达PD-L1主要通过T细胞释放的INF-γ诱导适应性上调,抗PD-1/PD-L1治疗获益最佳,而且预后相对较好;II型:肿瘤PD-L1阴性并且无TILs浸润,此类患者处于一种免疫无知（immune ignorance）状态,由于缺乏可检测的免疫反应,这类患者预后很差,单药检查点阻断很可能不会成功,在这种情况下,将考虑设计使T细胞进入肿瘤组织然后避免其功能被关闭的组合疗法;III型:肿瘤PD-L1阳性并且无TILs浸润,肿瘤细胞PD-L1表达主要来源于肿瘤内源性因素驱动,该类型免疫微环境强调单独的肿瘤PD-L1表达阳性不能作为对抗PD-1或抗PD-L1疗法的反应预测因素,因为在肿瘤微环境中没有TILs浸润,不可能解除PD-1/PD-L1导致的T细胞免疫抑制;IV型:肿瘤PD-L1阴性并且有TILs浸润,目前,此类患者免疫状态及预后情况并不明确,具体情况有待挖掘。IV型肿瘤免疫微环境中强调了其他免疫细胞的免疫抑制作用,比如髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cell,MDSC）,肿瘤相关巨噬细胞。此外,有意思的是,临床研究中发现,虽然此类微环境中肿瘤细胞PD-L1表达阴性,但仍有部分患者能够从抗PD-1治疗中获益。由此我们推测,即使肿瘤细胞PD-L1表达阴性,肿瘤微环境中其他细胞可能表达PD-L1并起到免疫抑制作用。然而,在肿瘤细胞PD-L1阴性的患者中,到底何种细胞表达PD-L1并发挥主要的免疫抑制作用,及其对患者预后有怎样的影响,尚不清楚。因此,本研究旨在分析非小细胞肺癌微环境中PD-L1的表达,研究肺癌微环境中表达PD-L1的免疫细胞及免疫细胞表达PD-L1的作用及机制,明确其对非小细胞肺癌患者预后的影响。研究方法:1、从TCGA数据门户网站（http://cancergenome.nih.gov/）下载1035例NSCLC患者的RNA测序数据进行基因表达分析。2、应用基因集富集分析（GSEA JAVA软件）分析PD-L1与生物过程/信号转导通路基因集的关系。3、应用多重定量荧光染色技术在同一组织标本同时进行CD68、CD163、CK、PD-L1、DAPI、PD-1、CD8指标染色,呈现非小细胞肺癌患者组织免疫微环境景观。4、采用蛋白免疫技术（Western blotting）检测目标蛋白表达。5、采用RT-qPCR实验方法检测目的基因mRNA水平表达。6、采用流式细胞术进行细胞分选及表面蛋白表达。7、采用脂质体介导siRNA转染,沉默基因表达。8、统计学分析:每项细胞实验均进行3次重复独立实验,实验结果以均值±标准差表示。使用SPSS 17.0统计软件进行t检验,卡方检验,Spearman秩相关检验和Fisher精确计算概率法。采用非参数检验进行组间比较。采用Kaplan-Meier法分析患者存活,并用对数秩检验进行比较。采用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析,以估计HR和95%CI。p<0.05有统计学意义。结果:1非小细胞肺癌PD-L1表达与MHCII类抗原提呈功能相关:下载TCGA1035例非小细胞肺癌患者数据,分为PD-L1高表达与PD-L1低表达组,通过GSEA功能富集分析发现,抗原识别及提呈功能与非小细胞肺癌组织中PD-L1表达有显著相关性。对富集结果中的参与抗原识别及提呈功能的81个差异基因进行Go分析发现这些基因主要参与MHC II类抗原提呈功能。2非小细胞肺癌组织中PD-L1表达与巨噬细胞正相关:将巨噬细胞标记物CD68与非小细胞肺癌CD274基因表达进行spearman相关性分析,发现二者存在正相关性（R=0.392,P<0.01）。多重线性回归方法纳入M1巨噬细胞标记物CD11c,NOS2以及M2巨噬细胞标记物CD206,CD163来分析巨噬细胞两种极化状态与非小细胞肺癌组织PD-L1表达的相关性,发现M2巨噬细胞标记物CD163（bata=0.332,P<0.01）是对肺癌组织PD-L1表达影响最大的指标。3非小细胞肺癌组织标本进行多重定量免疫荧光染色证明巨噬细胞与非小细胞肺癌PD-L1表达正相关:收集137例I-III期的非小细胞肺癌患者组织标本进行多重定量免疫荧光染色呈现肺癌免疫微环境景观。相关性分析显示,巨噬细胞数量与非小细胞肺癌患者组织PD-L1表达存在正相关性（R=0.7066,P<0.01）,且M2巨噬细胞与PD-L1相关性（R=0.5636,P<0.01）强于M1巨噬细胞（R=0.4688,P<0.01）,这与前文1035例NSCLC患者基因表达结果一致。证明巨噬细胞、尤其是M2型巨噬细胞是与非小细胞肺癌组织PD-L1表达相关。4非小细胞肺癌微环境中巨噬细胞丰富表达PD-L1:通过观察非小细胞肺微环境景观,发现巨噬细胞确实表达PD-L1。对137例非小细胞肺癌患者微环境中PD-L1表达进行详细分析,发现约88%的非小细胞肺癌患者微环境中巨噬细胞表达PD-L1阳性,且M2巨噬细胞PD-L1表达高于M1巨噬细胞。5非小细胞肺癌微环境景观分析巨噬细胞的分布特点:分析137例非小细胞肺癌微环境中巨噬细胞的数量、亚型及分布特点。结果显示,巨噬细胞数量占据整个肺癌组织的15.84%（占所有间质细胞的27.8%）。其中36.68%为M1型巨噬细胞,63.32%为M2型巨噬细胞。另外,有77.18%分布于肿瘤微环境间质区域（此部分定义为边缘型巨噬细胞）,而有22.82%浸润至癌巣中心部位（此部分定义为中心型巨噬细胞）。6巨噬细胞分布随肿瘤分期变化:接下来我们分析了巨噬细胞数量、分布和非小细胞肺癌分期之间的关系。从I期到III期,M2巨噬细胞总密度增加,M2极化状态（M2/M）也增加。另外,我们还观察了不同阶段肿瘤微环境中巨噬细胞浸润位置的特点。中心型M2巨噬细胞和边缘型M2巨噬细胞都随分期变晚逐渐增加,而中心型M1巨噬细胞在I期较少,II期迅速增加,同时边缘型M1巨噬细胞在II期显著减少,随后中心和边缘M1巨噬细胞在III期均减少,并且,随肿瘤发展至后期,微环境中巨噬细胞大部分均极化为M2状态。提示M2巨噬细胞在非小细胞肺癌的发展中起重要作用。7巨噬细胞数量与非小细胞肺癌病理学类型、EGFR状态及吸烟史相关:分析巨噬细胞与临床病理学参数的关系时发现,肺鳞癌患者,EGFR野生型患者以及吸烟患者巨噬细胞密度显著高于肺腺癌患者,EGFR突变患者及无吸烟史患者。分析M1和M2巨噬细胞时,发现了相同的结果。此外,各亚组间的M2极化状态（M2/M）基本相同。8巨噬细胞极化与分布影响非小细胞肺癌患者总生存:分析137例非小细胞肺癌患者的总生存时间（Overall Survival,OS）与巨噬细胞分布的关系。首先,总体M2巨噬细胞高浸润(M2^more)患者的总生存时间明显短于M2巨噬细胞低浸润(M2^less)患者（P=0.003）,而总体巨噬细胞密度和M1巨噬细胞密度不影响患者总生存。进一步分析发现,边缘型M1巨噬细胞高浸润患者的OS比边缘M1低浸润患者更佳（p=0.034）,而中心型M1巨噬细胞对患者生存无显著影响。中心型M2巨噬细胞低浸润的患者相比,中心型M2巨噬细胞高浸润的患者总生存时间更长（P=0.000）,而且边缘型M2巨噬细胞的高浸润也导致非小细胞肺癌患者总生存不良（p=0.036）。并且中心M2/边缘M2比值越大,患者总生存越差（p=0.001）,这表明中心M2对非小细胞肺癌患者总生存的影响更大。9中心型M2巨噬细胞高浸润是非小细胞肺癌患者总生存不良的独立预后因子:通过单变量和多变量COX分析得到,中心型M2巨噬细胞是非小细胞肺癌患者总生存的独立预测因子（HR=2.859,95%CI（1.125-7.262）,P=0.027）。10巨噬细胞极化与分布影响非小细胞肺癌患者无病生存时间:分析了137例非小细胞肺癌患者的无病生存时间（Disease-free Survival,DFS）与巨噬细胞分布的关系。总体巨噬细胞密度、总M1巨噬细胞密度及总M2巨噬细胞密度不显著影响患者无病生存时间,中心型巨噬细胞高浸润导致患者无病生存不良（P=0.023）。中心型及边缘型M1巨噬细胞均不影响患者无病生存时间。中心型M2巨噬细胞高浸润的患者比中心型M2巨噬细胞低浸润患者无病生存时间更短（P=0.006）,而且中心M2/边缘M2比值越大,患者无病生存时间越短（P=0.005）,说明M2巨噬细胞越向肿瘤中心浸润,患者预后越差。11中心型M2巨噬细胞高浸润是非小细胞肺癌患者无病生存不良的独立预后因子:通过单变量和多变量COX分析得到中心型M2巨噬细胞是非小细胞肺癌患者无病生存时间生存的独立预测因子（HR=2.859,95%CI（1.125-7.262）,P=0.027）。这些结果提示癌巣中心M2巨噬细胞浸润对非小细胞肺癌患者的预后有关键性影响。12 M2巨噬细胞与肿瘤PD-L1表达联合预后分析:联合分析M2巨噬细胞和肿瘤PD-L1表达对非小细胞肺癌预后影响,结果显示M2巨噬细胞低浸润且肿瘤细胞PD-L1阴性患者的总生存最佳,M2巨噬细胞高浸润且肿瘤细胞PD-L1阳性患者的总生存最差（p=0.027）。无病生存时间分析无显著统计学差异。进一步分析中心型M2巨噬细胞与肿瘤PD-L1表达联合对非小细胞肺癌患者预后的影响。结果显示,中心型M2巨噬细胞低浸润且肿瘤细胞PD-L1阴性患者的总生存和无病生存均是最佳,而中心型M2巨噬细胞高浸润且肿瘤细胞PD-L1阳性患者的总生存和无病生存最差（分别为P=0.002（总生存）、P=0.034（无病生存））。这些结果表明M2巨噬细胞和肿瘤PD-L1的联合分析可以提高对非小细胞肺癌预后预测的准确性。13 M2巨噬细胞是肿瘤微环境中表达PD-L1的重要免疫细胞,且为肿瘤细胞PD-L1阴性患者的PD-L1主要来源:无论肿瘤细胞是否表达PD-L1,88%患者的肿瘤微环境中巨噬细胞能够表达PD-L1。且肿瘤细胞PD-L1表达阴性的92例患者中,肿瘤微环境中PD-L1主要来源于巨噬细胞。巨噬细胞PD-L1更多表达于M2型细胞。14总体巨噬细胞PD-L1表达不影响肿瘤PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后:分析肿瘤微环境中总体巨噬细胞、总体M1细胞、总体M2细胞PD-L1表达对92例肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者总生存时间（OS）及无病生存时间（DFS）的影响。结果发现,无论是对非小细胞肺癌患者OS还是DFS,总体巨噬细胞PD-L1表达对其无显著影响。15中心型M2巨噬细胞PD-L1高表达导致肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后不良:对癌巣中心PD-L1表达预后作用进行分析,发现中心型巨噬细胞PD-L1表达及中心型M1巨噬细胞PD-L1表达对肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后无显著影响,而中心型M2巨噬细胞PD-L1高表达导致患者预后不良（OS:P=0.000;DFS:P=0.032）。16边缘型M1巨噬细胞PD-L1高表达导致肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后较好:对癌巣周边间质中巨噬细胞PD-L1表达进行预后分析,发现边缘型巨噬细胞PD-L1表达及边缘型M2巨噬细胞PD-L1表达对肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后无显著影响,而边缘型M1巨噬细胞PD-L1高表达导致患者预后较好（OS:P=0.000;DFS:P=0.032）。17中心型M2巨噬细胞PD-L1及边缘型M1巨噬细胞PD-L1是肿瘤PD-L1阴性非小细胞肺癌患者独立预后因素:通过单变量和多变量分析显示,中心型M2巨噬细胞PD-L1表达（OS:HR=10.332,95%CI（2.863-37.291）,P=0.000;DFS:HR=2.607,95%CI（1.337-5.085）,P=0.005）及边缘型M1巨噬细胞PD-L1表达（OS:HR=0.190,95%CI（0.068-0.534）,P=0.002;DFS:HR=0.413,95%CI（0.213-0.801）,P=0.009）为影响肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌患者总生存及无病生存时间的独立预后因子。18巨噬细胞PD-L1通过结合T细胞PD-1抑制CD8+T细胞活化从而导致免疫抑制:随机选取1例肺腺癌患者标本又进行了CD8和PD-1的染色,观察发现巨噬细胞表面PD-L1与CD8+T细胞表面PD-1存在结合,使用PMA对人单核细胞系THP-1进行诱导,使其分化为巨噬细胞,并对巨噬细胞进行PD-L1敲减;同时采集人外周血提取淋巴细胞,利用CD25/CD3抗体对T细胞进行激活,将巨噬细胞与活化的T细胞进行共培养,结果发现,表达PD-L1的巨噬细胞抑制CD8⁺T细胞活化,而敲减PD-L1的巨噬细胞对CD8⁺T细胞的抑制作用减弱,但对CD4+T细胞无显著影响。这进一步证明巨噬细胞表面PD-L1可通过结合CD8+T细胞表面PD-1,从而抑制T细胞功能,导致免疫抑制。19巨噬细胞PD-L1表达促进其向免疫抑制表型转化:沉默巨噬细胞PD-L1基因表达,发现巨噬细胞PD-L1减低后,代表其抗炎作用的效应因子,包括IL-1,IL-6,TNF-α,Arg-1等,均发生升高,证明巨噬细胞PD-L1表达抑制其炎性因子的释放,使巨噬细胞向免疫抑制表型转化。结论:1、非小细胞肺癌微环境中巨噬细胞浸润丰富,其数量及分布与非小细胞肺癌发生发展密切相关;2、巨噬细胞数量与非小细胞肺癌患者组织类型、EGFR状态及吸烟史相关;3、癌巣中心M2巨噬细胞高浸润是非小细胞肺癌患者预后不良的独立预后因子;4、巨噬细胞与非小细胞肺癌PD-L1表达正相关;5、巨噬细胞是表达PD-L1的重要免疫细胞,肿瘤细胞PD-L1阴性非小细胞肺癌中巨噬细胞是PD-L1的主要来源;6、癌巣中心型M2巨噬PD-L1高表达是肿瘤PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后不良的独立预后因子;7、边缘型M1巨噬PD-L1高表达是肿瘤PD-L1阴性非小细胞肺癌患者预后较好的独立预后因子;8、巨噬细胞PD-L1通过抑制T细胞功能及促进自身表型转换导致免疫抑制。