第一部分:类脑救治脑创伤创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)简称脑创伤,是指暴力作用于头部而造成的脑组织器质性损伤。根据脑创伤后是否与外界相通可分为闭合性脑损伤和开放性脑损伤。TBI是目前创伤相关死亡的主要原因,同时也是四十岁以下人群致残的主要原因。目前针对TBI的治疗主要包括早期的现场急救、头部清创和后期的神经功能恢复治疗。对于其所导致的神经功能障碍除了后期的康复治疗能够恢复部分神经功能外,目前临床上并没有有效的治疗方法。类脑器官(cerebral organoid,CO)是指利用胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)或者诱导的多功能干细胞采用“3D”培养技术,通过添加不同的诱导因子使其分化成含有多种类型神经细胞和不同大脑分区且具有一定功能的三维神经结构,简称类脑。与传统的细胞培养相比,CO包含多种类型的神经细胞如神经干细胞、多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元等,同时分化出多种大脑区域特性如背侧皮质、脉络丛、前脑腹侧等。另外,CO还再现人类大脑发生的多个过程如外放射状细胞区域的形成。总之,与传统的神经细胞系相比CO包含了更加丰富的神经细胞类型、大脑区域特性同时具有一定的神经功能。TBI的干细胞移植治疗在多个动物模型上已被证明有效。但是目前对TBI进行CO移植治疗还没有报道。因此本实验通过构建特殊的大鼠TBI模型使用不同培养天数的CO进行移植治疗,进而研究CO移植对TBI的治疗效果,同时比较不同培养天数的CO移植治疗效果的差异。另外本实验还初步探究了CO在TBI治疗中的作用机制。实验方法1.根据参考文献培养实验所需的CO,同时选择适当培养天数的CO进行免疫荧光染色、细胞计数等比较分析55d-CO和85d-CO间细胞数量和细胞成分的差异。2.实验前一周对Sprague-Dawley大鼠进行平衡木训练使其能快速顺利通过平衡木。随后将大鼠随机分为假手术组(只进行开颅不破坏脑组织)、创伤组(机械损伤大脑皮层不进行CO移植)、55d-CO移植组(机械损伤大脑皮层同时移植培养了55天的CO)、85d-CO移植组(机械损伤大脑皮层同时移植培养了85天的CO)。大鼠进行开颅手术,使用活检穿孔器在大鼠的右侧感觉运动皮层造成损伤,使其出现一定的神经功能障碍。对大鼠大脑皮层造成损伤后立即进行CO的移植。在手术后的第2、5、7、11、14、21、28、35、42天分别对55d-CO移植组、创伤组和假手术组大鼠进行行为学评估。行为学评估采用mNSS(modified neurological severity scores)评分表和平衡木实验,计算各组大鼠的得分情况,评估大鼠术后神经功能恢复情况。3.分别在大鼠术后的第7、14、28和56天对55d-CO移植组、85d-CO移植组、创伤组和假手术组大鼠进行麻醉取脑。将各组大鼠的脑组织进行Brd U/Nestin、Brd U/DCX、Brd U/Neu N等指标的免疫荧光染色同时对相应的阳性细胞进行计数,观察和分析各组大鼠脑损伤后,脑损伤周围区、海马SGZ(subgranular zone)、SVZ(subventricular zone)的神经细胞增殖分化的情况。另外对各组大鼠脑组织进行IL-1α(Interleukin)、TNF-α(Tumor necrosis factor)和ICAM(Intercellular cell adhesion molecule)炎症相关指标的免疫组化染色和血清ICAM水平的ELISA检测,观察损伤周围区炎症浸润和血液水平的炎症情况。同时分离各组大鼠脑损伤同侧的大脑海马,提取蛋白进行突触后密度蛋白(postsynaptic density protein 95,PSD95)、突触小泡蛋白(synaptophysin,SYN)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等蛋白的Western blot,分析其表达情况,初步分析CO移植对脑创伤保护作用的机制。4.分别在术后的第7、14、28、56天对55d-CO移植组的大鼠进行麻醉取脑,随后对获取的脑组织和移植的CO进行冰冻切片。对移植的CO进行Olig2、Chat、v Glut1、SATB2、STEM121等指标的免疫荧光染色,观察分析移植的CO在宿主体内的存活、生长分化和神经迁移等情况。同时进行血管化相关指标(CD31和CD105)的免疫荧光染色和免疫组化染色,观察移植的CO是否与宿主大脑形成血管连接。实验结果1.通过对不同培养天数的CO进行细胞计数和免疫荧光染色可以发现:随着培养天数的增加,神经干细胞的数量不断下降,而成熟神经元的数量不断增加。当培养到80天左右时CO出现不同的大脑分区。另外,CO的细胞量也随着培养天数的增加而增加,85d-CO的细胞量几乎是55d-CO的两倍。2.通过对各组大鼠脑损伤区、海马SGZ、SVZ的新生神经细胞和神经干细胞进行Brd U/Nestin、Brd U/DCX、Brd U/Neu N等指标的免疫荧光染色和统计分析发现:CO移植组新生神经元和神经干细胞数量明显多于创伤组和假手术组,而且55d-CO移植组的新生神经元和神经干细胞要多于85d-CO移植组,说明CO移植能促进TBI大鼠神经再生且55d-CO移植有更好的效果。另外,在移植后的第2、5、7、11、14、21、28、35和42天对55d-CO移植组、创伤组和假手术组大鼠进行mNSS评分和平衡木实验,评估大鼠的神经功能恢复,发现CO移植可以明显改善TBI大鼠的神经功能。3.通过对55d-CO移植组大鼠脑组织进行Olig2、Chat、v Glut1、SATB2、STEM121等神经标记物的免疫荧光染色,发现CO在大鼠脑内能够较长时间的存活,分化成多种运动皮层区的神经细胞,同时CO的细胞还在大鼠脑内进行广泛的迁移。另外,通过CD31和CD105的免疫荧光和免疫组化染色证明了移植的CO与大鼠大脑皮层发生了血管连接。通过Western blot检测55d-CO移植组、创伤组和假手术组大鼠脑损伤同侧海马的PSD95、SYN、BDNF等表达水平,发现55d-CO移植组与创伤组相比上述的神经连接蛋白和神经营养因子在移植后不同时间点出现了不同程度的上调。实验结论1.不同培养天数的CO的细胞数量和细胞成分存在较大差异。与55d-CO相比85d-CO神经元比例更高,神经干细胞比例较低,同时有更多的细胞数量。2.CO移植可以促进脑创伤大鼠神经再生,改善脑创伤大鼠神经功能,其中55d-CO移植有更高的细胞存活率和更好的神经保护作用。3.移植的CO可以在大鼠脑内存活分化成多种运动皮层区的神经细胞,同时还能进行细胞迁移和与大脑皮层形成血管连接。4.CO移植可以上调脑创伤大鼠脑内神经连接蛋白和神经营养因子的表达。第二部分:Nampt基因编辑对胚胎干细胞生长影响的研究烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl-transferase,Nampt)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)生物合成的限速酶,决定着细胞产生NAD的水平和速率,在细胞的能量代谢中有重要作用。同时,研究表明Nampt在促进细胞的增殖分化,调控细胞凋亡等方面也有重要作用。van der Veer等研究证实Nampt可以促进血管平滑肌细胞的成熟分化,还可以延长血管平滑肌细胞的寿命。目前,Nampt对人胚胎干细胞增殖分化的作用还鲜有报道,本实验主要通过CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞上进行Nampt基因的敲除,进而研究Nampt基因敲除对人胚胎干细胞的存活及生长的影响。实验方法1.根据gRNA靶基因的设计原则设计gRNA序列,构建CRISPR/Cas9载体。2.培养人胚胎干细胞,当细胞融合率达到70%左右时消化细胞,使用电转仪进行电穿孔转染。3.在电转后使用含0.3μg/ml嘌呤霉素的m Te SR1培养基进行抗药性筛选,挑选耐药克隆,进行PCR测序验证。4.选取同一批次的生长状态良好的胚胎干细胞待其长到70%左右时,培养基中给予不同浓度的Nampt抑制剂FK866(0.3 nmol/L,1 nmol/L,3 nmol/L,10 nmol/L)。给药48小时后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。实验结果1.人胚胎干细胞电穿孔转染后,给予0.3μg/ml嘌呤霉素筛选5天,待细胞系扩增后,提取DNA,进行sanger测序,结果显示Nampt基因没有被编辑。2.为了保证能够快速获得细胞系,降低嘌呤霉素筛选浓度(0.1μg/ml)筛选5天。随后,待细胞系扩增后,挑取上述的单克隆提取DNA后,进行PCR扩增后测序。结果显示也无被编辑的细胞系。3.在电转后第一天添加ROCK抑制剂Y27632(10μmol/L),同时进行0.3μg/ml嘌呤霉素抗性筛选,3天后得到混合细胞系,提取DNA后,进行PCR扩增测序。测序结果显示Nampt基因3个碱基被删除。7天后再次对该混合细胞系提取DNA进行sanger测序,结果显示Nampt基因未被编辑。4.0.3 nmol/L、1 nmol/L、3 nmol/L和10 nmol/L的Nampt抑制剂FK866对胚胎干细胞的生长抑制率分别为2.95%±0.01、13.75%±0.01、90.05%±0.01和95.61%±0.02,各剂量组均显示统计学差异。实验结论Nampt基因对维持人胚胎干细胞生长具有不可缺少的重要作用,Nampt基因的缺失会导致细胞死亡。