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鸡白痢沙门氏菌是引起鸡白痢的病原菌,在家禽养殖业中可造成一定比例的病鸡或带菌鸡,从而带来经济损失,因而对抑鸡白痢沙门氏菌的细菌素产生菌的研究有重要的应用价值。
本研究从植物源材料中筛选到了一株可抑制鸡白痢沙门氏菌生长的产细菌素菌株V528。首先对该菌株和所产细菌素的生物特性进行了研究。为了提高细菌素的效价,进一步利用紫外线诱变菌株以筛选高产菌株和利用发酵实验以优化发酵条件,并对所获细菌素进行了初步的纯化。
菌株V528对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的抑制作用,根据其形态及生理生化特征,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》,最终确认该细菌可归为乳酸乳球菌属(Lactococcuslactis)。
在排除酸性产物和过氧化氢的干扰后,V528菌株的发酵液对鸡白痢沙门氏菌仍具有明显的抑菌效果。发酵液经胃蛋白酶处理后,其抑菌活性明显下降,证明该活性物质具有蛋白质性质为细菌素。
对V528菌株进行紫外线二次复合诱变,筛选得到三株细菌素产量提高且遗传相对较稳定的菌株,其中Lact.174菌株的细菌素活性较V528的细菌素活性增加61.54%,从而确定该菌株为进一步实验研究用菌。
对Lact.174菌株的发酵条件的研究表明,Lact.174菌株发酵产生细菌素的最佳培养基为MRS。本文还研究了培养温度,培养基起始pH值,培养基碳源、氮源,刺激因子等因素对细菌素产量的影响。组合因素优化结果为:蔗糖20g,牛肉浸膏10g,酵母粉5.0g,磷酸氢二钾2.0g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,吐温-805mL,PEG-60001g,乙醇10ml,乙酸0.05ml,定容至1L,起始pH为5.5,以6小时种龄的菌种接种量为2%,30℃培养14h。在此培养条件下细菌素效价可达到8147.04IU/ml,与起始培养基相比细菌素效价提高了1.4倍。
菌株发酵上清液经旋转蒸发仪进行浓缩,用丙酮提取,采用考马斯亮兰试剂盒测定蛋白质含量,不同批次提取的蛋白含量在0.75~1.52mg/ml之间,通过Tricine-SDS-PAGE电泳,估计出其分子量小于14.4kDa,为小分子多肽。