蓝莓中可萃取多酚与不可萃取多酚对巨噬细胞抗炎作用的研究

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多酚是植物体内复杂的酚类次生代谢产物,具有多元酚结构,主要存在于植物的皮、根、叶、壳及果肉中。蓝莓中含有大量多酚类物质,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。传统的多酚提取方法主要集中在可萃取多酚(EPP),而忽视了不可萃取多酚(NEPP)。本文研究了蓝莓中EPP和NEPP的提取、分离纯化方法和组成,并进一步以RAW264.7细胞为模型,研究比较了EPP和NEPP对炎性细胞因子的分泌和基因表达的影响,探讨了蓝莓中EPP和NEPP的抗炎作用和差异性机理。通过这些研究提高了蓝莓的利用价值,增强了对蓝莓多酚的认识。本论文以新鲜蓝莓作为研究对象,首先使用超声微波辅助法对蓝莓果中可萃取多酚进行提取实验,利用Box-Behnken的中心组合旋转试验设计,通过响应面法建立了蓝莓EPP提取的二次多项数学模型,优化制备工艺,得到最佳工艺条件为:50%乙醇萃取液、料液比1:25(m/v)、超声时间75min、超声功率750W、微波时间45s、微波功率340W,在该条件下EPP含量为14.56±0.2mg/g。利用超声微波联用技术大大提高了蓝莓中EPP的提取率。然后利用超声辅助技术对提取EPP的蓝莓渣进行二次利用,使用NaOH溶液提取NEPP,采用Box-Behnken的中心组合设计及响应面分析,通过验证试验获得最优萃取条件,在超声功率400W条件下,NaOH溶液浓度为3.0mol/L,超声时间为5h,液料比为1:20时可以获得最大多酚提取率为(5.43±0.3)%。收集获得的EPP及NEPP溶液,利用乙酸乙酯及大孔树脂对两种多酚进行进一步纯化并冻干成粉保存,经过纯化后多酚含量大大提高。通过高效液相色谱技术对两种多酚的成分进行分析,两种多酚的组成都主要是燕草色素类、飞燕草色素类、牵牛花色素类、矢车菊色素类、芍药花色素、锦葵色素类和乙酰化的花色苷。最后本研究首次对蓝莓中两种多酚的抗炎效果及作用机理进行试验,以小鼠巨噬细胞RAW264.7为试验载体,用LPS诱导生成炎症模型,运用ELISA法测定蓝莓中EPP和NEPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌量的影响。结果表明EPP和NEPP明显抑制IL-1β的分泌,促进IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α的分泌。进一步通过实时定量PCR测定EPP和NEPP对巨噬细胞以上各因子基因表达的影响,EPP和NEPP明显抑制IL-1β、IL-6mRNA的表达,促进IL-10、IL-12mRNA的表达,但对TNF-α的基因表达影响不明显。总体培养时间在12-48h的作用效果较好。试验结果表明,蓝莓中的两种多酚EPP及NEPP均具有良好的抗炎作用,EPP的抗炎效果要好于NEPP。
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