一、目的甲状腺癌（thyroid carcinoma,TC）是增长较快的一种恶性肿瘤,每年新发病例约56.7万,过度诊断和过度治疗是TC热点争议。甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma,PTMC）占据了50%以上的甲状腺癌新发病例。PTMC的总体预后较好,其术后复发率和疾病相关性死亡率分别为:0.36-7.4%和0-1.0%,如何科学管理并给予个体化治疗,减少过度治疗,是当前临床重点研究内容。临床上,超声和CT等影像检查淋巴结转移阴性的PTMC病例称为cN₀-PTMC;实际上,cN₀-PTMC病例的颈部淋巴结转移的发生率高达15.3-49.2%。PTMC占了甲状腺临床的重要权重,对于cN₀-PTMC,其临床争议的关键是如何准确地评估cN₀-PTMC的淋巴结转移风险,从而能够指导个体化治疗的实施:对高风险cN₀-PTMC选择手术切除+中央区淋巴结清扫,对中-低风险的cN₀-PTMC选择恰当的手术次全切除或者非手术切除的治疗方案（如微波消融、射频消融及临床随诊观察等）。肿瘤的发生和发展机制十分复杂,是多基因共同作用的结果,我们研究从基因分子层面结合高分辨力的超声影像来协同预测cN₀-PTMC患者颈部淋巴结转移的风险,克服传统影像手段评估颈部淋巴结（特别是中央区淋巴结）转移能力的不足,解决cN₀-PTMC个体化治疗方案（手术切除选择和范围、微创消融及随诊观察等）选择的循证依据,并探索微波消融这一非手术治疗在中-低风险的cN₀-PTMC的临床应用。二、方法1.甲状腺微小乳头状癌BRAF基因与超声影像特征关系的研究病例来源于2014年5月到2017年12月江苏大学附属医院291例甲状腺癌手术切除和颈部淋巴结清扫的病例,所有病例的甲状腺病灶直径均大于5mm,在手术切除前,均完成了超声引导下的细针穿刺（fine needle aspiration,FNA）标本取材。排除标准:（1）甲状腺癌的直径大于1cm;（2）没有FNA-BRAF基因分析结果;（3）没有完整的超声影像资料。最后116例PTMC病例入组本部分研究。收集患者完整的临床和病理资料,包括年龄、性别、桥本甲状腺炎情况、BRAF^V600E突变情况。检测、手术病理颈部淋巴结转移情况。（1）甲状腺微小乳头状癌超声影像特征分析入组的116例甲状腺微小乳头状癌结节被分别分析,分析结节的大小、数目、位置、回声、边缘、微小钙化、纵横比、包膜侵犯、距离包膜距离等超声影像特征。（2）入组的116例甲状腺微小乳头状癌BRAF基因突变分析首先在超声引导下行FNA,在获得了突变的BRAF基因15号外显子PCR扩增的条件和引物后,使用QIAamp-DNA-FFPE组织试剂盒（QIAGEN）提取穿刺标本基因组DNA,应用DNA直接测序法,将第15号外显子通过PCR扩增后,在ABI Prism3730遗传分析仪（Applied Biosystems,Foster City,CA）测序试剂盒上终止循环测序反应及序列读取,了解是否存在BRAF^V600E基因突变。（3）分析BRAF^V600E基因突变与超声影像特征关系统计甲状腺微小乳头状癌的超声影像特征和BRAF^V600E基因突变结果,连续变量检验采用秩和检验,交叉检验分析分类变量。多因素回归分析用来评估超声影像特征和BRAF^V600E突变的关系。双尾P<0.05表示统计学显著差异。2.BRAF^V600E检测结合超声影像特征预测cN₀-甲状腺微小乳头状癌的中央区淋巴结转移的风险回顾性连续收集2015年10月至2017年12月期间232名在江苏大学附属医院进行了甲状腺切除术加常规中央区淋巴结（central lymph node metastasis,CLNM）清扫的患者。入组标准:（1）术前均行超声引导下FNA;（2）超声影像特征资料齐全;（3）术后病理资料和临床资料齐全。排除标准:（1）既往甲状腺切除史;（2）超声测量肿瘤>10 mm;（3）拒绝BRAF^V600E分析;（4）超声图像缺失或不足。最后,有182例PTMC病例符合条件纳入本研究,从电子临床和病理记录中获得这些患者的年龄、性别、BRAF^V600E突变、CLNM和慢性淋巴细胞性甲状腺炎等在内的临床及病理信息。（1）超声影像特征图像每个结节分别由两位经验丰富的超声科医生对其研究,在他们互相不知道临床病理特征和FNA标本的BRAF基因的结果,应用标准化的甲状腺影像报告分析系统（thyroid imaging report and data system,TI-RADS）,回顾性独立阅读每个PTMC的超声影像特征,并记录。当两位放射科医生之间出现分歧时,由另外一位高年资超声医生回顾分析超声影像特征,并做出最终决定。（2）BRAFV600E突变分析同前述。（3）统计分析统计分析采用SPSS软件（版本19.0,美国SPSS公司）。t检验用于比较连续变量,卡方检验和fisher检验用于比较分类变量。双尾P≤0.05被认为具有统计学意义。3.微波消融治疗中-低风险cN₀-PTMC的安全性和临床疗效研究回顾性分析2014年5月-2018年6月江苏大学附属医院超声引导下微波消融中-低风险的cN₀-PTMC32例。所有入选患者均符合以下标准:（1）经超声引导下FNA细胞学为PTC,单发,超声影像上没有其他可以结节;（2）PTC病灶最大直径不大于10mm;（3）PTMC病灶未突破包膜,未侵犯气管、食管及周围肌肉血管;（4）超声影像上,无颈部淋巴结转移征象;（5）BRAF^V600E基因野生型;（6）患者甲状腺TSH、FT3、FT4均在正常范围;（7）患者经医护人员充分告知微波消融相关风险后,仍拒绝外科手术,也拒绝密切随访的。排除病例:（1）随访时间<6个月,中断随访的2例;（2）PTMC手术切除术后复发的,消融病例1例;（3）消融术后,继续行手术切除病例1例;（4）消融前FNA-Bethesda 5级病例,回顾超声影像特征TI-RADS:3类,未确诊病例1例。最后,27例PTMC微波消融病例入组这部分数据统计分析。（1）超声引导设备彩色多普勒超声实时监控引导,应具备实时超声造影功能。（2）微波消融设备（1）微波源（微波治疗仪）,2450MHz或915MHz两种频率肿瘤消融的微波源,常用2450MHz频率。功率:15-45W,常用35W;（2）消融针（消融天线）,硬质裂隙水冷式消融针,穿刺简便、中心碳化区少、耐高温、抗粘及不易损坏等特点,直径:12-18G,常用16G。（3）微波消融功率及消融时间微波消融功率25-35W。通过调整功率及消融时间确保消融范围完全覆盖肿瘤,并且扩大消融范围至肿瘤边缘2-5mm。在保证充分热消融甲状腺结节的同时,避免热传递到邻近周围组织一般需要由小至大逐步调节。（4）消融过程患者取仰卧位,常规消毒、铺巾,超声引导下利多卡因局部皮下浸润麻醉,利多卡因+生理盐水麻醉并隔离甲状腺前包膜麻醉,超声监视下细针注入生理盐水至甲状腺内后方,有效隔离喉返神经、气管及食管距离甲状腺包膜1cm以上,超声监视下,避开胸锁乳突肌、彩超可见的血管、颈动脉和颈内静脉进针。采用固定靶点消融技术,将消融针芯插入PTMC病灶中心偏前方,25-35W功率消融至覆盖至病灶边缘外2-5mm,超声造影确认消融范围是否完全覆盖消融灶,有可疑消融不全地方,重新进针消融。消融完成,记录消融过程用时、消融功率、病人一般情况（必要时对症处理）、术中疼痛评分等。三、结果1.甲状腺微小乳头状癌BRAF基因与超声影像特征关系的研究（1）总体情况116例PTMC病例,患者平均年龄43.66±12.11岁,肿瘤平均大小7.28±1.58mm（5-10mm）。实质性结构的PTMC114例,占98.3%;极低回声PTMC22例,占19.0%。钙化结节75枚,其中:72枚微小钙化、占77.0%,粗大钙化结节3枚、占2.6%。纵横比>1的PTMC56枚,占到48.3%,边缘模糊的结节75枚,占64.7%。34例患者（34/116,29.3%）有桥本甲状腺炎背景。淋巴结转移的患者28例,在116例中占比24.1%。BRAF^V600E基因突变病例70例,在本部分病例中占比60.3%（70/116）。（2）BRAF^V600E基因和超声影像特征、临床病理特征的关系病灶多灶性特征的PTMC,在BRAF^V600E突变组和BRAF^V600E野生组发生率分别为58.6%（41/70）和17.4%（8/46）,具有统计学差异意义（P<0.000）。纵横比>1结节,在BRAF^V600E突变组和BRAF^V600E野生组发生率分别为65.4%（46/70）和21.7%（10/46）,P<0.000。其他的超声影像特征,如边缘模糊、低回声、极低回声等,在BRAF^V600E基因突变组和BRAF^V600E基因野生组之间未见统计学意义（P>0.05）。在临床病理特征上,淋巴结转移28例,在BRAF^V600E基因突变组和基因野生型组分别为:23例（23/70,32.9%）和5例（5/46,10.9%）,具有统计学差异（P=0.008）。其他临床特征,如性别、年龄、桥本甲状腺炎等在BRAF^V600E突变组和未突变组未见统计学差异。（3）多因素回归分析BRAF^V600E基因突变和超声影像特征、临床病理特征的关系多因素回归分析结果,多灶性、纵横比>1和淋巴结转移是预测BRAF基因突变的特征指标,其优势比（odds ratio,OR）分别为:3.681、3.181和4.615,p值分别为:0.031、0.041和0.009。2.BRAF^V600E检测结合超声影像特征预测cN₀-甲状腺微小乳头状癌的中央区淋巴结转移的风险（1）总体特征分布在182例患者中,可疑的超声表现包括实体成分、明显的低回声、微钙化、不规则/分叶状边缘和纵横比>1,分别见于98.9%、17.6%、59.3%、69.8%和45.6%的PTMC患者中。有55例（30.2%）PTMC病例合并慢性淋巴细胞性甲状腺炎。BRAF^V600E突变87例,占182例病例的47.8%。（2）不同临床病理及超声特征的cN₀-PTMC患者的CLNM分布特征BRAF^V600E突变者CLNM阳性率高64.8%,BRAF^V600E基因未突变的CLNM阳性率高35.2%（P<0.001）。在PTMC的超声特征中,肿瘤大小（P=0.027）、多灶性（P=0.009）和明显低回声（P=0.028）与CLNM的存在显著相关。其他超声表现,包括实性成分、微钙化、边缘不规则或呈分叶状以及纵横比>1,都与CLNM无关（P>0.05）。（3）多因素logistic回归分析PTMC的CLNM多因素Logistic回归分析检验临床病理和超声特征与CLNM阳性风险之间的独立相关性,肿瘤>7mm的特征（OR=3.636,95%CI,1.671-7.914,p=0.001）,显著低回声（OR=2.686,95%CI:1.080-6.678,P=0.002）,多灶性（OR=4.184,95%CI:1.707-10.258,P=0.002）和BRAF^V600E突变（OR=5.339,95%CI:2.529-11.272,P<0.001）是临床PTMC阴性患者发现CLNM的独立危险因素（表3.2）。（4）BRAF^V600E突变和超声影像特征预测颈部淋巴结转移将上述（3）中确定的显著预测因子计算每个患者的风险评分,并使用风险评分构建ROC曲线,曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.755,预测的敏感性为63.4%,特异性为80.2%。（5）BRAF^V600E野生型和超声影像特征预测颈部淋巴结不转移BRAF^V600E基因野生型和超声特征中淋巴结转移低危预测因子,采用多因素分析回归分析,结果显示肿瘤大小≤7 mm、非显著低回声、单发病灶和BRAF^V600E基因野生型对淋巴结转移阴性具有统计学预测价值（P<0.05）,其OR值分别为:1.291、0.988、1.431和1.675,这些因素通过ROC曲线分析,AUC为0.716。3.微波消融治疗中-低风险cN₀-甲状腺微小乳头状癌的安全性和临床疗效研究（1）术前患者一般情况27例PTMC患者27个病灶,患者平均年龄43.22±16.37岁（21-61岁）,男性8例、女性19例,伴有桥本甲状腺炎2例。PTMC病灶平均直径7.2±3.3mm（4.5-10.0mm）,体积0.13±0.08ml（0.06-0.42ml）。（2）手术过程情况消融麻醉用量,2%利多卡因10-30ml,平均用量18±8ml。术中疼痛评分1.71±0.65（范围:0-4）,未发生严重疼痛病例。所有27例PTMC微波消融患者,发生1例颈部进针小静脉出血,经微波消融即时消融出血点后术中止血,未发生颈部大出血、颈部皮肤烧伤等严重并症,无1例喉返神经损伤。所有27例消融病例,5例门诊消融手术,22例日间病房住院1天。（3）消融术后甲状腺功能所有消融病例,术后3个月开始给予左旋甲状腺素钠片抑制治疗,TSH降至<0.05μIU/L。术前1周与术后1个月、3个月的甲状腺相关激素水平（FT3、FT4及TSH）未见统计学差异（P>0.05）。（4）术后病灶随访情况所有27个PTMC病灶消融后在第3个月大小开始明显缩小,体积减小率达48.6±11.6%;到第6个月时,体积减小率达85.6±17.7%。27枚PTMC结节,消融后完全吸收18例,未完全吸收PTMC结节9枚。未完全吸收的9枚结节中,7枚消融后随访时间<9个月,1枚结节消融后随访时间13.5个月,1枚结节消融时间26个月。所有27例PTMC病例中,术后超声和CT随访未见淋巴结复发病例。1例男性患者在消融术后23个月对侧甲状腺新发PTMC病灶（直径4.6mm）,给予再次消融,随访9个月时未见甲状腺及颈部淋巴结复发。四、结论（1）在中国的PTMC人群中,BRAF^V600E基因突变比例相对较高。PTMC的BRAF^V600E基因突变与肿瘤的多灶性、纵横比>1的超声影像特征以及颈部淋巴结转移存在显著性联系。（2）肿瘤>7mm、显著低回声、多灶性和BRAF^V600E突变是预测cN₀-PTMC患者颈部淋巴结转移的独立性因素,FNA-BRAF^V600E检测结合超声影像特征预测cN₀-PTMC患者淋巴结转移具有良好的预测价值。（3）FNA-BRAF^V600E基因野生型结合超声影像特征预测cN₀-PTMC患者没有淋巴结转移,具有一定的预测价值。（4）微波消融治疗中-低风险的_CN₀-PTMC具有很好的临床安全性和微创特性。（5）微波消融治疗中-低风险的_CN₀-PTMC在中期随访结果上,能够达到局部根治的疗效。总的说来,对于_CN₀-PTMC患者,术前癌灶的FNA标本BRAF基因检测结合超声影像特征能够预测其颈部淋巴转移风险,对于中-低风险的_CN₀-PTMC患者采用超声引导下微波消融治疗具有很好的安全性和局部根治效果。