背景和目的糖尿病是临床最常见的慢性代谢性内分泌病。随着改革开放后社会的飞速发展和人民群众物质文化需求的改变,糖尿病人越来越多,其发病率也是逐年增长,临床工作中发现在糖尿病各型病人中,2型糖尿病患者数量最多,而且发病年龄趋向于年轻化。在生活水平提高的同时,糖尿病患者对生活质量和审美的要求也越来越高,因此,国内糖尿病患者的牙齿正畸需求日趋旺盛,而异常的高糖(high glucose,HG)状态和晚期糖基化终末产物会导致全身骨代谢紊乱,破坏牙槽骨骨代谢的平衡,严重影响了正畸的疗效,这已经成为临床正畸治疗亟待解决的问题之一。与其它骨骼一样,牙槽骨的稳态也是通过骨吸收和骨形成之间的动态平衡来维持。正畸牙齿移动依靠机械力引起的牙槽骨改建,受压力侧破骨细胞活性增强引起牙槽骨吸收,受张力侧成骨细胞活性增强形成新骨。牙齿受到机械力的刺激后便会激活牙槽骨的重建。近来研究表明,骨细胞是早期机械性骨重建的主要靶点。骨细胞是骨组织中最丰富的细胞,具有细胞突起,突起间的间隙连接将多个骨细胞连接在一起,构成星网状结构,使细胞信号可以在多个细胞间传递,使代谢产物在此通道内交流和互换。骨细胞在体内的受力形式为外界应力作用于骨,刺激骨陷窝小管中的组织液流动,产生作用于骨细胞的流体剪切应力。大量实验亦证明,在体外环境中,骨细胞较为敏感的力学刺激信号是流体剪切应力。骨细胞作为机械感受细胞,感受外界应力刺激,并将生物力学信号转化为生物化学信号传递给其他骨组织细胞,如成骨细胞、破骨细胞等来控制骨吸收和骨形成,是整个牙槽骨代谢的重要调控者。二甲双胍(Metformin,MF)是目前临床上治疗2型糖尿病的一线药物,降糖作用显著。近来研究发现,二甲双胍除了降糖作用以外,还具有很多作用,尤其是二甲双胍对骨的直接保护作用成为研究的热点。但是,目前关于糖尿病对正畸牙移动的不利影响,以及二甲双胍对骨代谢有何作用的研究报道大都集中在成骨细胞和破骨细胞上,而二者对于骨细胞的影响则鲜见报道。鉴于骨细胞在调控骨改建过程中的重要作用,在本实验中,我们在体外建立流体剪切应力施加模型,运用小鼠骨样细胞系MLO-Y4作为研究对象,研究在流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响,二甲双胍干预对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理的骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞会产生何种诱导效应;在体内建立大鼠2型糖尿病正畸牙齿移动模型,施加二甲双胍,研究二甲双胍在2型糖尿病大鼠牙移动过程中对骨细胞及骨改建的作用,并从组织学的角度寻找二甲双胍影响牙槽骨骨细胞的证据。总之,本课题通过体内体外实验研究二甲双胍在流体剪切应力和高糖环境下对骨细胞的影响及机制,从骨代谢重要调控者--骨细胞的角度,为临床糖尿病正畸患者提供治疗思路和有力的理论依据。材料与方法1.流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响在施加流体剪切力的基础上,以不同浓度葡萄糖(5.5、11、22、33、44、66mM)干预骨样细胞MLO-Y4,葡萄糖(5.5 mM)为对照组,应用细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况;流式细胞仪测细胞凋亡率;细胞免疫荧光技术测施加流体剪切应力对MLO-Y4细胞的影响;矿化诱导测不同葡萄糖浓度下骨样细胞的矿化情况;qRT-PCR和Western blot技术检测各标志物mRNA和蛋白的变化。2.流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.1流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞MLO-Y4的作用在施加流体剪切力的基础上,将骨样细胞进行两种不同的处理:1)使用HG22mM高糖培养基培养2周后,添加不同浓度的二甲双胍,继续培养;2)使用HG22mM高糖培养基培养2周后,更换为普通培养基,并添加不同浓度的二甲双胍,继续培养。设置葡萄糖(5.5 mM)复合二甲双胍(0μM)为对照组,应用细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况;流式细胞仪测细胞凋亡率;矿化诱导检测不同葡萄糖浓度下骨样细胞的矿化情况;qRT-PCR和Western blot技术检测各标志物mRNA和蛋白的变化。2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响收集上述不同处理的骨样细胞培养上清液,培养小鼠前成骨细胞MC3T3-E1,运用流式细胞仪检测不同处理的骨样细胞培养上清液对成骨细胞凋亡的影响;矿化诱导测成骨细胞的矿化能力;qRT-PCR和Western blot技术检测各成骨相关标志物mRNA和蛋白的变化。使用小鼠RAW264.7细胞诱导破骨细胞,并在诱导过程中施加不同处理的骨样细胞培养上清液,观察其对破骨细胞形成数目和功能的影响。3.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨样细胞MLO-Y4的机制初探3.1生物信息学分析通过DrugBank数据库,找到二甲双胍的作用靶点,然后,通过String数据库,找到10个与二甲双胍的作用靶点PRKAB1密切相关的基因,然后通过KEGG数据库、GO数据库和上述基因来预测二甲双胍参与调控的生物学过程和影响到的信号通路。3.2 Western Blot 实验检测流体剪切应力下,高糖培养基(HG22mM)培养骨样细胞14d,更换无血清培养基培养12h,之后添加1M二甲双胍,在Omin,5min,15min,30min,60min,90 min,2h-10h,收集细胞蛋白,Western blot技术检测不同信号通路随时间点的变化。4.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨细胞的体内研究购买SPF级Wistar大鼠并建立2型糖尿病大鼠模型,设置上颌第一磨牙近中移动加力装置,一组经胃灌注给予100mg/kg/day的二甲双胍(二甲双胍组),另一组给予同量生理盐水作为对照(糖尿病组);正常大鼠复合正畸组作为空白对照(正常组)。每周称量体重,同时检测血糖水平,正畸2周后麻醉,口内取模测量牙齿移动距离,4%多聚甲醛心脏灌注法处死动物,取上颌骨行固定、脱钙、制作石蜡切片,伊红-苏木素(HE)染色观察牙槽骨组织形态的变化;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)复合碱性磷酸酶(ALP)双重染色,观察破骨细胞和成骨细胞的变化;免疫组织化学染色观察骨细胞标志物硬骨素(sclerostin,SOST),牙本质基质蛋白-1(dental matrix protein-1,DMP-1)的表达变化。结果1.流体剪切应力下,高糖对骨样细胞MLO-Y4的影响1)细胞免疫荧光显示:流体剪切应力施加组,F-actin蛋白亮度明显增加,细胞突触增长;2)CCK-8法检测细胞增殖和流式细胞仪检测细胞的凋亡率,结果显示:MLO-Y4细胞在葡萄糖作用3天后,11、22mM葡萄糖组,呈剂量依赖式促进细胞增殖(p<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.05)。而33、44、66mM葡萄糖组抑制细胞增殖(P<0.05),促进细胞的凋亡(p<0.05),66mM组促凋亡作用最为明显(P<0.01);3)矿化诱导结果显示:随着葡萄糖浓度的增高,矿化结节形成减少,钙含量呈剂量依赖式降低(p<0.05);4)qRT-PCR和WB结果显示:随着葡萄糖浓度(5.5-66mM)的升高,OPN,OCN,DMP-1的表达呈剂量依赖式递减;SOST的表达和RANKL/OPG的比值呈剂量依赖式递增。2.流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞的作用以及高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.1流体剪切应力下,二甲双胍对高糖致损骨样细胞MLO-Y4的作用2.1.1在流体剪切应力和高糖环境下,添加不同浓度的二甲双胍(MF0-800μM)1)CCK-8检测增殖活性和流式细胞仪检测凋亡率,结果显示:不同浓度的MF(100-800μM),均可促进MLO-Y4细胞的增殖,降低其凋亡率,峰值出现在MF400μM。2)矿化诱导结果显示:不同浓度的MF(100-800μM),均能促进MLO-Y4细胞的矿化,以MF100μM浓度的作用最为明显。3)qRT-PCR结果显示:在MF 100-2000μM范围内,OCNmRNA,OPNmRNA的表达增高,在 MF 100μM 时达到峰值;在添加 MF 400-800μM 时,OCNmRNA,OPNmRNA的表达降低,MF800μM下降的幅度较大;在MF100-800μM范围内,DMP-1mRNA的表达呈剂量依赖式增高,SOSTmRNA的表达呈剂量依赖式降低;RANKL/OPGmRNA的比值呈剂量依赖式下降。4)WB结果显示:低浓度MF 100-200μM,可以在一定程度上缓解高糖对OCN、OPG、DMP-1的抑制作用,高浓度MF 400-800μM,缓解作用明显。同时,低浓度MF 100-200μM可以在一定程度上降低高糖对SOST,RANKL的促进作用,高浓度MF 400-800μM作用更明显。2.1.2在流体剪切应力和高糖环境下培养细胞14天后,更换普通培养基,并添加二甲双胍(MF0-800μM)1)MF0-400μM,均能促进细胞增殖,降低细胞凋亡率,峰值出现在MF 100μM,而添加MF800μM会抑制细胞增殖,促进其凋亡。2)矿化诱导结果显示:不同浓度MF0-800μM,均能明显的促进骨样细胞MLO-Y4的矿化,MF2000μM浓度作用最为明显。3)在MF100-800μM范围内,OCNmRNA、OPNmRNA的表达均增加,在添加MF200μM时OCNmRNA、OPNmRNA的表达达到峰值;在MF 100-800 μM范围内,DMP-1mRNA表达增高,SOSTmRNA表达降低;在施加MF400μM时,DMP-1mRNA表达量最高,SOSTmRNA表达量最低;RANKL/OPGmRNA的比值呈剂量依赖式下降。4)WB结果显示:相比对照组,添加二甲双胍组别能明显的促进骨样细胞MLO-Y4中OCN、OPG、DMP-1蛋白的表达,降低RANKL和SOST蛋白的表达。2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞和破骨细胞生物学特性的影响2.2.1高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对成骨细胞的影响1)流式细胞仪检测凋亡结果显示:在按1:1比例添加正常成骨细胞培养液加各种不同处理骨样细胞上清液后,高糖骨样细胞上清液和高糖加MF 200μM组凋亡率增高,高糖更换普通培养基并添加二甲双胍组,凋亡率降低。2)矿化诱导结果:高糖骨样细胞上清液处理组,矿化结节形成的最少,高糖加二甲双胍组较高糖组增多,但是对比正常对照组和单纯二甲双胍处理组仍较低。而高糖更换普通培养液并添加二甲双胍组,矿化结节呈剂量依赖式增多。3)qRT-PCR和Western结果显示:高糖骨样细胞上清液组中COL I、OPG和OCN表达明显降低,高糖加MF200μM组中上述因子的表达有所提升,但相比正常对照组和单纯MF处理组仍较低;而在高糖更换普通培养基并加二甲双胍组COL-I呈剂量依赖式增加;OPG、OCN在MF200-400μM范围内呈剂量依赖式增加。RANKL在高糖骨样细胞上清液组和高糖加200μM二甲双胍组均表达较高,在高糖更换普通培养基并加MF组,RANKL表达呈剂量依赖式降低。2.2.2高糖处理和二甲双胍处理骨样细胞MLO-Y4上清液对破骨细胞的影响1)破骨细胞数目:高糖处理骨样细胞上清液能明显促进破骨细胞的生成,破骨细胞形成多且面积较大;高糖复合MF处理骨样细胞上清液能改善高糖对破骨细胞生成的影响,降低破骨细胞的数量和面积;高糖更换普通培养基后再添加MF组,呈剂量依赖式抑制破骨细胞的形成。2)破骨细胞功能:高糖处理骨样细胞上清液组,破骨细胞功能活跃,形成的骨陷窝面积最大;高糖复合MF骨样细胞上清液组,破骨细胞的功能较高糖组减弱;高糖更换普通培养基后再添加MF组,破骨细胞形成的陷窝面积呈剂量依赖式减少,差异有统计学意义。3.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨样细胞MLO-Y4的机制初探3.1.生物信息分析1)通过Drugbank数据库,查询到二甲双胍的作用靶点为5’-AMP-activated protein kinase subunit beta-1,基因名为 PRKAB1。通过 String 数据库中查询到 10 个与 PRKAB1 密切相关的基因:PRKAG1、PRKAA2、PRKAA1、PRKAG2、PRKAG3、STK11、ULK1、ACACA、TP53、MTOR;2)通过 KEGG 数据库检索到二甲双胍涉及的信号通路主要有:AMPK、mTOR、Adipocytokine、Insulin、Regulation of autophagy、Glucagon、Insulin resistance、Circadian rhythm、Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)、Oxytocin 信号通路。其中,与二甲双胍关系最为密切的信号通路是AMPK信号通路(pValue:1.03E-31);3)通过GO数据库,检索到二甲双胍涉及的生物学进程主要有细胞周期停滞、蛋白磷酸化、大自噬、p53类调控因子介导的信号转导调控、脂肪酸生物合成进程、基因表达正向调控、营养水平的细胞反应、自噬的正向调控、肉碱穿梭、前列腺素E激活的细胞反应等密切相关。3.2.Western Blot 实验检测在二甲双胍作用于高糖致损的骨样细胞后,p-Ampk,p-Erk,和p-Jnk的表达量随时间变化(5min-10h)呈现出表达升高-降低等周期性的变化。p38和NF-κB信号通路中的p-p65在检测的时间段(5min-10h)未见表达的改变。4.流体剪切应力下,二甲双胍调控高糖致损骨细胞的体内研究1)2型糖尿病大鼠正畸牙齿模型成功建立,血糖值明显高于正常对照组(p<0.05),二甲双胍用药组血糖值与正常组无明显差异(p<0.05);2)二甲双胍组较糖尿病组牙齿移动距离减少(p<0.05),与正常组无统计学差异(p>0.05);3)二甲双胍组与糖尿病组相比,破骨细胞减少,ALP表达增强(p<0.05),与正常组比较无统计学差异(p>0.05);4)免疫组织化学染色显示,二甲双胍组相较于糖尿病组,骨细胞中SOST阳性骨细胞所占比值减少,而DMP-1阳性骨细胞所占比值增加(p<0.05),上述因子表达与正常组比较无明显差异(p>0.05)。结论1.流体剪切应力下,低浓度高糖(11mM-22mM)可以促进骨样细胞的增殖和活性,高浓度高糖(33mM-66mM)则抑制骨样细胞的增殖和活性,促进其凋亡;随着葡萄糖浓度的增高(1 1mM-66mM),正向调控矿化相关因子OPN,OCN,DMP-1的表达呈剂量依赖式递减,负向调控矿化因子SOST的表达和RANKL/OPG的比值呈剂量依赖式递增,骨样细胞矿化能力减弱。2.流体剪切应力下,二甲双胍可以改善高糖致损骨样细胞的增殖活性和功能,使高糖诱导表达升高的SOST表达下调,表达降低的DMP-1表达上调,进而影响骨样细胞对成骨细胞和破骨细胞的调控功能,增加骨形成能力和降低骨吸收能力。同时,在流体剪切应力下,二甲双胍在高糖环境中,需要一定的浓度来改善高糖致损骨样细胞的活性和对成骨破骨的调控功能;而在正常葡萄糖环境中,二甲双胍则可以较好地逆转高糖致损骨样细胞的活性和对成骨破骨的调控功能。3.流体剪切应力作用下,AMPK、ERK、JNK信号通路参与了二甲双胍对高糖致损骨样细胞的调控。而p38信号通路,NF-κB信号通路(p65)未参与该调控过程。4.糖尿病使骨细胞高表达SOST,低表达DMP-1,增强了正畸力作用下破骨细胞的数目和活性,损伤了成骨细胞的功能,导致了牙齿移动距离加大。应用二甲双胍干预后,二甲双胍逆转了糖尿病对骨细胞的损害,使SOST和DMP-1的表达趋于正常化,降低了破骨细胞的数量和活性,并在一定程度上改善了成骨细胞活性,促使牙齿移动正常化。