各类内源物质和外源化合物在人体内的代谢是一个十分复杂的过程,过去人们认为这种代谢可以分为两步完成。即由细胞色素氧化酶P450(CYPs)为主要代谢酶催化的一相代谢反应和由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)为主要代谢酶催化的二相代谢反应。一般认为,CYPs的主要作用是对药物分子进行结构修饰,例如在分子结构上加上一个羟基,使其更为亲水。而UGTs的主要作用是在一相代谢的基础上,将辅因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)上的葡萄糖醛酸基团转移到药物分子的羟基上,使药物水溶性提高,更利于通过尿液或胆汁排出体外。但是最新研究表明,化合物在体内的代谢并非严格遵守一相至二相的顺序,大多情况下,二者是同时并存关系。更有可能有些物质只经过CYPs代谢就排出体外,也有些本身就带有羟基集团的化合物不经过CYPs催化,直接经由UGTs代谢后排出体外。UGTs是非常重要的药物代谢酶,可以代谢将近35%的药物,使之失活。除药物外,UGTs还可以介导致癌物质的解毒过程,以及维持体内内源物质,如激素和胆红素的体内平衡。前文提到,UGTs的代谢解毒原理主要为在底物分子的羟基基团上连接葡萄糖醛酸基团,使产物亲水性提高,因而更易通过尿液或胆汁排出体外。这个过程需要辅因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸提供葡萄糖醛酸基团。UGTs的底物结构十分多样化,除羟基外,含有羰基,羧基,巯基以及氨基的化合物都可以成为底物。事实上,整个反应为R-OH(或R-CO,R-COOH,R-SH,R-NH2)作为亲核试剂的SN2亲核取代反应,最终形成了更为亲水的产物β-D-葡糖苷酸。UGTs之所以具有多样化的底物结构,最主要的原因是UGTs是一个具有多个同工酶的超家族。人类UGT酶有22种同工酶,可被分为四个家族,UGT1A、UGT2(可分为UGT2A和UGT2B)、UGT3和UGT8。其中UGT1A和UGT2B家族的UGT同工酶承担了大部分的外源物质代谢解毒过程。它们也是需要着重考虑的酶。因此,了解这些酶在体内的分布及表达十分有助于药物代谢的毒理学研究。肝脏作为最主要的代谢器官,多种UGT同工酶都在其中表达。其中,UGT1A家族的一些同工酶(1A1,1A4,和1A9)和UGT2B家族的一些同工酶(2B4,2B7,和2B15)表达水平相较于其他高出许多。但是其他同工酶,如UGT1A3,1A6,2B10,2B11和2B17的表达量为中等水平。而UGT1A5,1A7,1A8,1A10和2B28表达水平极低。胃肠道也是UGT酶催化代谢的主要场所,在药物的代谢过程中发挥重要作用。UGT1A1,1A4,2B7以及2B15在胃肠道中表达量相较其他较高,而UGT1A3,1A7,1A8,1A9,2B4,2B7,2B10,2B11和2B28在胃肠道中表达量极低。除此之外,肾脏中的代谢过程也是药物解毒排出体外不可缺少的环节。肾脏中,表达水平最高的为UGT1A6,1A9以及2B7。药物代谢意义上的药物与药物间相互作用是指一种药物对代谢另一种药物的代谢酶产生了影响,从而造成另一种药物在人体内累积而致使其浓度升高超过治疗窗,产生毒性。UGTs在药物代谢中发挥极其重要的作用。因此,近年来因UGTs功能受到影响而导致的药物与药物相互作用相关报道屡见不鲜。例如,丙戊酸作为一种抗癫痫和抗抑郁药物,服用后对人体内UGT2B7功能具有抑制作用。而UGT2B7为一系列药物(包括扑热息痛,阿莫三嗪,齐多呋定)的主要代谢酶。丙戊酸与这些药物的同时服用无疑会导致这些药物在人体内的代谢过度积累,从而引起毒副作用。除药物与药物相互作用外,因遗传性的基因差别而导致药物代谢途径发生改变同样会造成药物的药理学性质发生变化。而UGTs是一类遗传性差异发生频率很高的代谢酶。UGTs的单核苷酸多态性以及基因拷贝数变异普遍存在于不同人种间,因其造成的药物代谢过程差异同样是人们关注研究的重点。因变异导致的UGTs功能降低或缺失与多种疾病及药物毒性反应存在联系。例如,抗癌药物依替立康的抗癌疗效主要依赖于其在人体内的初始代谢物SN-38,而SN-38在具有极高的抗癌活性同时,其对血细胞的毒副作用也十分明显。而SN-38在体内代谢过程主要由一些UGT1As负责,因此UGT1As因变异导致的功能缺失会造成SN-38的体内累积,产生严重的毒副作用,造成白细胞减少症。此外,胆红素水平是评判肝功能好坏的重要指标。其作为内源物质,主要由UGT1A1进行代谢,而UGT1A1为目前已知的变异型最多的UGT同工酶。一些变异型会导致UGT1A1功能活性降低,从而使血液中胆红素水平升高,有可能造成黄疸。现今,研究各个UGT同工酶功能的方法有很多。较为常见的是使用人肝微粒和微生物或细胞系重组表达UGT酶作为酶源,来研究单个同工酶的活性区别。但这些方法各有利弊。人肝微粒的好处是,储存及使用简便,反应时间短,适合高通量筛选底物。而其缺点亦十分明显,人肝微粒造价昂贵,来源困难,存在批次差异,以及无法用于研究一些只在肝外表达的UGT同工酶。而另一种较为常用的方法是微生物(如大肠杆菌或酵母)重组表达人类UGTs。在本组之前的实验研究中,曾用裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)成功共表达了人类19种UGT同工酶(UGT1A和UGT2家族)以及其辅因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA),并基于此进行了一系列全细胞转化实验。优点是因为共表达了辅因子,因此无需在反应体系中人为投放辅因子,大大降低了实验成本。但是这种全细胞转化实验缺点也很明显。UGTs位于内质网内侧,属于膜蛋白。全细胞生物转化方法中,因为完整细胞具有多层的生物屏障(如细胞壁、细胞膜、内质网膜),底物穿透这些屏障到达UGT酶位置进行生物反应的过程受到阻碍,而生成的产物要经过同样的生物屏障排出细胞外。因而此种方法产率低,耗时长。为了克服这些缺点,在本项研究中,我们建立并优化了基于渗透性重组表达人类UGTs的裂殖酵母的研究方法。此种方法将裂殖酵母细胞用适当渗透剂处理,使其表面细胞膜形成孔洞。这些孔洞大小可允许底物,辅因子以及产物分子自由进出,而UGTs因其分子结构过大而留在细胞内,因而反应时间缩短,产率提高,获得更高效率比。我们将这种方法称为酶包法。为了验证酶包法的实行的可能性以及高效率,我们进行了一系列实验。首先,因为渗透剂不但会对细胞膜产生影响,而且高浓度情况下还会影响酶的活性。因此,我们探究了一系列渗透剂浓度对UGT酶活性的影响,同时使用人肝微粒作为对照。基于本组之前的实验研究,我们选择Triton X-100作为渗透剂。研究结果表明相较于人肝微粒,递增的Triton X-100浓度与UGT活性成正比,并在0.3%浓度时达到最高。因此在后续研究中,酶包法中Triton X-100浓度被固定为0.3%。此项试验证明了酶包方法在运用于UGT酶上的可能性。随后,为了证明酶包法的高效性,我们选取11α-羟基孕酮作为底物,分别进行酶包法转化和全细胞转化。结果显示,酶包法获得的产物为全细胞转化法获得产物的将近四十倍,这一数据有力证明了酶包法的高效性。接着,我们使用酶包法进行了酶活性抑制实验,成功测定了甲芬那酸抑制UGT1A9的IC50值,所得数据(IC504.1μM,with a 95%CI of 2.5 to 6.4μM R2=0.97)与之前被发表过的数据十分接近。使用普罗麦格公司(Promega)提供的发光底物,我们成功为三种UGT同工酶(UGT1A5,UGT2B11,和UGT2B28)发现了新底物。同时,我们发现UGT1A5还可以催化氨基的葡萄糖醛酸转移反应,这是从未被发现和报道过的。此外,对于UGT1A5错义突变的生物信息学研究表明,UGT1A5有两个之前从未被发现的变异型,其一为九倍突变(UGT1A5*8),其二为六倍突变(UGT1A5*9)。我们成功在裂殖酵母中表达了这两种突变型,并以野生型UGT1A5作为对照,使用发光底物测试了其活性。结果表明,无论是O-葡萄糖醛酸化还是N-葡萄糖醛酸化,UGT1A5*8的活性总是高于UGT1A5*9和野生型UGT1A5。同源建模和分子底物对接研究表明,在所有突变中,UGT1A5*8中的Gly259Arg突变为关键性因素。该突变通过新形成的氢键网,稳定了helix Q的结构。相较于野生型UGT1A5,该结构的稳定有助于辅因子与酶的结合。最后,因为体育竞赛中兴奋剂滥用情况日渐猖獗,而兴奋剂的UGTs代谢产物在兴奋剂检测和监控中起到重要作用,我们决定使用基于UGTs的酶包法对兴奋剂的代谢情况进行一定研究。此次实验中,我们使用酶包法研究了19种人类UGT酶对兴奋剂普萘洛尔及其一相代谢产物4-羟基普萘洛尔的代谢情况。除了已被发现的UGT1A9,我们还发现了两种新的UGT同工酶(UGT1A7和UGT1A8)也可以代谢普萘洛尔和4-羟基普萘洛尔。此外,4-羟基普萘洛尔还被另一种UGT同工酶(UGT2A1)代谢。更为有趣的是,我们还发现了UGT1A7,UGT1A8和UGT1A9均对普萘洛尔具有立体选择性。