分子育种技术创制高香型矮牵牛的初步研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:kejianghaoxl
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花朵香气在吸引昆虫促进授粉、植物应对外源伤害方面有重要作用[1],同时它也是一种具有强烈审美和情感价值的重要园艺性状[2]。花朵挥发性有机物被广泛应用于香水、日化用品、调味品以及药品的生产和制造行业[1]。花朵挥发性有机物主要有萜类化合物,苯类化合物,脂肪酸衍生物三大类,他们的生物合成途径是一个十分复杂的网络,存在许多交叉、重叠和竞争关系。为获得一种新香型的矮牵牛,本研究基于花香合成途径方面的研究成果,将茉莉花香气合成关键基因构建于花特异性启动子之下,并转化矮牵牛,筛选转基因阳性植株,对其香气成分、表型进行记录和测定,并进一步检测了转基因材料中香气合成途径中的关键结构基因和转录因子表达水平的变化。主要结果如下:1、构建花特异性表达载体pK7FWG2.0-proLIS:JsTPS4。将山字草属仙女扇(Clarkia breweri)花特异性表达启动子CbLIS通过酶切连接替换掉pK7FWG2.0表达载体的CaMV35S启动子,获得pK7FWG2.0-proLIS双元载体。将茉莉花香气合成关键基因JsTPS4通过同源重组构建于上述双元载体上,获得pK7FWG2.0-proLIS:JsTPS4表达载体。2、将pK7FWG2.0-proLIS:JsTPS4转化农杆菌GV3101,通过叶盘法转化矮牵牛。经Kan筛选,获得转基因材料T0代共33株,转基因材料植株生长情况与野生型并无明显差异。部分转基因材料出现了叶片皱缩,部分转基因材料花朵出现皱缩或增生。转基因矮牵牛材料T0代的Kan基因经PCR检测,共有28株含有Kan抗性基因。将转基因矮牵牛材料T0代种子使用Kan筛选培养基筛选获得T1代53株,转基因矮牵牛材料T1代的Kan基因经PCR检测,L 22-7系中含Kan抗性基因的植株2株;L 44-1系中含Kan抗性基因的植株21株;L 66-3系中含Kan抗性基因的植株13株。JsTPS4基因表达量显著提高,在2 d 23:00 JsTPS4基因的表达量相较于野生型中该基因的表达了提高了20~800倍,在3 d 23:00 JsTPS4基因的表达量相较于野生型中该基因的表达了提高了25~500倍。3、转基因材料香气成分的鉴定及含量分析。使用正己烷提取转基因材料花朵中的香气物质,经GC-MS检测,发现苯甲酸甲酯和苯甲酸苄酯的含量相较于野生型发生明显变化,苯甲酸甲酯的含量为野生型的1.21~3.94倍,苯甲酸苄酯的含量为野生型的1.57~14.35倍。总香气质量为野生型的1.09~1.38倍。部分株系中检测到苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇的含量上升。4、基于转基因矮牵牛材料的香气成分中苯类物质含量显著增加的现象,本研究初步探究了与苯类合成途径合成相关的8个结构基因(PhEPSPS、PhCM1、PhADT、PhPAL、PhPAAS、PhKAT1、PhBPBT、PhBMST1)及三个转录因子(PhODOⅠ、PhEOBⅠ、PhEOBⅡ)的表达模式。苯类合成途径中苯丙氨酸合成的上游基因(PhEPSPS、PhCM1、PhADT)的表达量相较于野生型均显示出了上调的趋势,而其下游基因(PhPAL、PhPAAS、PhKAT1、PhBPBT、PhBMST1)的表达量在不同株系中差异较大。转录因子PhODOⅠ的表达量与其直接作用的PhEPSPS、PhCM1、PhADT、PhPAL、PhPAAS的表达量变化趋势一致,存在一定的相关关系。本研究获得了香气物质苯甲酸甲酯(1.21~3.94倍)和苯甲酸苄酯(1.57~14.35倍)显著提高的矮牵牛育种材料,为将来改良花卉香气的研究提供了育种材料。
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