欧李再生体系的建立和NAC1基因功能的初步研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:oliversong
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欧李(Cerasus humilis)为蔷薇科樱桃属果树,是多年生落叶矮生灌木,它抗寒、耐旱、耐瘠薄、耐盐碱,具有固土保水、防止沙尘、减少地表径流的作用,适应性很强,是优良的生态树种。但目前有关欧李的抗旱机制还尚不明确,本研究首先通过组织培养技术成功建立了欧李的再生体系,试验分别以叶片、茎段为外植体,通过诱导愈伤组织和促进腋芽生枝能力两种途径对欧李(怀柔)进行快繁。同时,基于欧李抗旱性强的特点,我们从前期获得的欧李转录组数据出发,从欧李叶片中克隆并获得全长NAC基因,并初步进行了功能的研究。本研究一方面通过成功建立欧李快繁技术,为后续欧李的遗传转化体系的构建奠定基础,另一方面通过对NAC基因的初步研究,为揭示欧李抗旱的分子机制提供线索。主要研究结果如下:1、通过诱导愈伤组织成功建立了欧李的再生体系(1)外植体的最适消毒条件是:外植体在流水下冲洗30min,75%酒精表面消毒1.0min,1%NaClO消毒4min,无菌水涮洗6-7次。(2)以叶片为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为:MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+1.0mg/L6-BA+0.6mg/LNAA;以茎段为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为:MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/L6-BA+0.8mg/LNAA。(3)最适愈伤组织扩增PGR浓度为:0.5mg/L6-BA+0.6mg/L 2.4-D。(4)由愈伤组织再分化为芽的最适PGR浓度为:5.0mg/L 6-BA+0.9mg/L NAA。(5)促进腋芽生枝芽的最适培养基为:MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+2.0mg/L 6-BA+ 0.9mg/L NAA。(6)由芽诱导生根阶段最佳最适培养基为:1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA.2、从欧李叶片中克隆并获得全长NAC基因命名为ChNAC1(KP314213.1),该基因全长为997bp,开放阅读框894bp,编码297个氨基酸,预测蛋白分子量为33.94kD,理论等电点pI为8.09,定位于细胞核。3、我们进一步融合CaMV35S启动子构建ChNACl基因的高效植物表达载体,通过冻融法将载体pROK2-ChNAC1转入感受态农杆菌EHA105中,利用农杆菌介导浸花法转化拟南芥,构建ChNACl高效表达转基因拟南芥,选择性培养基筛选获得两株转基因株系line1和line4,ChNAC1特异性引物PCR检测转基因植物为阳性。对获得纯系转基因植株进行20d干旱处理和复水7天处理,测量叶片的叶绿素含量和对ABA敏感试验,初步的结果表明转基因植株有更好的抗旱能力和对ABA的敏感性。
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