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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)是禽类支原体感染中最重要的病源微生物之一,引起禽类的慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease, CRD),该病广泛分布于世界上所有养禽的国家,对家禽业造成严重的经济损失。microRNAs是一类长度18-25nt的非编码微小分子RNAs,主要通过识别特殊序列进行转录后基因表达的调控。当外界病原微生物进入宿主后,宿主体内miRNAs呈现不同丰度的表达,且在病原微生物感染不同时期以及由于病原微生物种类的不同,宿主体内miRNAs表达量发生变化。因此,通过研究宿主细胞感染病原前后miRNAs的表达变化及其靶标功能,不仅有助于揭示了该病的致病机制,还为实现基因治疗提供理论依据。本实验组前期通过MG感染鸡胚,深度测序发现,处理组中gga-miR-99a的表达量显著下调,gga-miR-146c的表达量显著上调,表明gga-miR-99a、gga-miR-146c可能在MG引起的疾病中发挥调控作用。本研究主要运用Q-PCR研究不同时期MG感染鸡胚肺组织中miR-99a和miR-146c的表达量；通过生物信息学方法预测靶基因,并进行验证；利用超表达和RNAi技术研究靶基因的功能,初步阐明gga-miR-99a、gga-miR-146c在MG感染中的调控机制。本研究的主要成果如下：(1)采用Q-PCR检测不同时期MG感染鸡胚肺组织中miR-99a的表达量,13d、14d、16d、17d肺组织中gga-miR-99a的相对表达量在感染MG后极显著上调(p<0.01),12d、15d、19d、20d肺组织中gga-miR-99a的相对表达量在感染MG后极显著下调(p<0.01)。(2)通过TargetScan和miRDB预测gga-miR-99a的靶基因,初步选定SMARCA5作为gga-miR-99a的靶基因。进一步运用双荧光素酶报告基因验证,结果显示,与NC组、突变载体组、空载体组相比,gga-miR-99a能够极显著抑制SMARCA5 3’UTR的双荧光素酶报告基因的表达(p<0.01)。同时,DF-1细胞中超表达gga-miR-99a后,与NC组相比,SMARCA5相对表达量极显著下调(p<0.01)；抑制gga-miR-99a后,与Inhibitor NC相比,SMARCA5相对表达量极显著上调(p<0.01)。此外,12d感染组肺组织中SMARCA5的相对表达量极显著上调(p<0.01)；16d感染组肺组织中SMARCA5的相对表达量极显著下调(p<0.01),该结果与同时期肺组织中gga-miR-99a的表达趋势相反。(3)DF-1细胞中转染gga-miR-99a 24h、48h、72h,结果发现,转染72h后,DF-1细胞增殖率显著下降(P<0.05)；同时,转染gga-miR-99a后检测DF-1细胞周期,与阴性对照相比,G1期水平明显升高(P<0.05), G2期基本保持不变(P>0.05)。(4)采用Q-PCR检测不同时期MG感染鸡胚肺组织中miR-146c的表达量,13d、14d极显著下调(p<0.01),而18d、19d、20d极显著上调(p<0.01)；16d、17d显著上调(p<0.05)。(5)通过TargetScan和miRDB预测gga-miR-146c的靶基因,初步选定MMP16、 TRAF7作为gga-miR-146c的靶基因。进一步运用双荧光素酶报告基因验证,结果显示,与NC组、突变载体组、空载体组相比,gga-miR-146c能够极显著抑制MMP16、 TRAF7 3’UTR的双荧光素酶报告基因的表达(p<0.01)。同时,DF-1细胞中超表达gga-miR-146c后,与NC组相比,MMP16、TRAF7的相对表达量极显著下调(p<0.01)；抑制gga-miR-146c后,与Inhibitor NC相比,MMP16、TRAF7相对表达量极显著上调(p<0.01)。(6)DF-1细胞中超表达gga-miR-146c后,与NC组相比,TLR6、TLR2、Myd88、 TNF-a相对表达量极显著上调(p<0.01), Apoal无显著性差异；抑制gga-miR-146c后,与Inhibitor NC相比,Apoa I相对表达量极显著上调(p<0.01), TLR6、TLR2、 Myd88、TNF-α无显著性差异。