以PAMAM为间隔臂的仿生物特异性免疫吸附材料的点击法制备及其性能研究

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以氨基酸为配体,树枝状大分子聚酰胺-胺(PAMAM)为间隔臂,根据点击化学的原理设计和制备对免疫球蛋白(IgG)具有高选择性,且成本低廉、安全、吸附性能与蛋白A吸附材料相当的新型免疫吸附材料。通过系统地考察含不同间隔臂的免疫吸附材料对人血浆中IgG的吸附性能,研究免疫吸附材料的间隔臂长度、结构和刚/柔性等对配体偶联和免疫吸附材料的吸附性能的影响,从而探索一条能简单,高效、可控地制备仿生物特异性的非蛋白类免疫吸附材料的新途径。用廉价、稳定、安全且具有可修饰性的的氨基酸小分子为仿生配体代替常用的蛋白A制备免疫吸附材料,可避免蛋白类免疫吸附材料价格高昂、易脱落,存在安全隐患等缺陷;采用点击化学——Huisgen1,3-偶极环加成反应来实现配体与活性载体的偶联,可大大增强这两者间的反应选择性,从而增加配体的固载量和稳定性。此外,点击反应条件温和,在较宽范围的溶剂、温度和pH下均可发生,且对很多官能团呈惰性,因而很少甚至没有副产物,能尽量保持配体官能团的完整性和活性,从而保持其对抗体的亲和力。另一方面,选择外层带有大量活性官能团的PAMAM树枝状大分子为间隔臂,则可望利用这些官能团键接比线型间隔臂多得多的配体,从而提高所设计和制备的免疫吸附材料的配体含量,并改善其吸附性能。基于上述研究背景和思路,本课题主要开展了以下几个方面的研究和探索:(1)以琼脂糖凝胶(Sep)为载体,用常规法制备了分别以不同氨基酸(AA)为仿生配体的免疫吸附材料Sep-AA;测定了它们的配体含量,并通过对人血浆中IgG的吸附试验,对比分析了Sep-AA和用相同方法制备的蛋白A免疫吸附材料Sep-PA的吸附性能。(2)基于Huisgen1,3-偶极环加成反应的原理和要求,分别将载体Sep和配体AA通过适宜的化学修饰制备成―可点击‖的叠氮化活性载体Sep-N3与含炔基的配体;将二者偶联制备了仿生物特异性的非蛋白类免疫吸附材料Sep-triazole-AA;表征了Sep-triazole-AA的配体含量和对人血浆中IgG的吸附性能,并与常规法制备的免疫吸附材料Sep-AA进行对比分析,研究了点击化学对吸附材料的结构和性能的影响。(3)以炔丙胺为核心,采用发散法合成了0.5~4.0代端基炔化的PAMAM树状大分子,并表征和分析了所得产物的结构,为将PAMAM用作免疫吸附材料的间隔臂奠定了基础。(4)通过树状大分子PAMAM外层的官能团与配体AA的反应,制得带端炔基树状间隔臂的“可点击”配体,并将这一配体偶联到―可点击‖的活性载体Sep-N3上,以制备带树状间隔臂的免疫吸附材料Sep-PAMAM-AA;表征了其结构、配体含量和吸附性能,并与间隔臂为线型分子链的相应的吸附材料Sep-triazole-AA进行对比分析,研究了树枝状间隔臂PAMAM的结构与免疫吸附材料的IgG吸附性能之间的关系。从本课题的研究可得到的主要研究结果如下:(1)在免疫吸附材料Sep-AA的常规法制备中,琼脂糖载体上的活性基团含量随着环氧化、胺化、醛基化和配体的偶联等一系列反应的进行而逐步减少,使得所制备的分别以L-组氨酸(His)、L-苯丙氨酸(Phe)和L-色氨酸(Trp)为配体的免疫吸附材料Sep-His、Sep-Phe和Sep-Trp的配体含量较低。它们对IgG的吸附容量分别为2.88、2.62和2.53mg/g,远低于蛋白A吸附材料Sep-PA的IgG吸附容量22.97mg/g;所制备的Sep-AA对人血浆中的IgG有较高的选择性,几乎没有非特异性吸附。这一结果证明了氨基酸作为仿生配体的可行性。(2)用点击化学的方法成功地合成了三种以不同氨基酸为配体的免疫吸附材料Sep-triazole-His、Sep-triazole-Phe和Sep-triazole-Trp。它们的配体含量和对人血浆中IgG的吸附容量均明显地优于相应的用常规法制备的免疫吸附材料Sep-AA;其中,Sep-triazole-His的IgG吸附容量最高,达到16.49mg/g,但仍比不上Sep-PA。研究进一步证明,Sep-triazole-His具有与Sep-PA相当的对IgG的高吸附选择性;其间隔臂结构中由点击反应生成的三唑环能够促进IgG的结合而不引起非特异性吸附。(3)成功地设计与合成了G1.0~G4.0共4代外层带大量氨基的炔化PAMAM;并用点击化学的方法制备了带有不同的树状间隔臂和不同的氨基酸配体的免疫吸附材料Sep-PAMAM-AA。对产物结构的分析表明,在四种间隔臂G1.0~G4.0PAMAM中,以G3.0PAMAM键接的配体数最多,键接效率也最高。氨基酸修饰的PAMAM与活性载体Sep-N3的点击反应选择性很高,反应效率接近100%;所得免疫吸附材料Sep-PAMAM-AA对人血浆中IgG的吸附容量均较高,大部分能与蛋白A免疫吸附材料相媲美。其中,用G3.0PAMAM作间隔臂的免疫吸附材料Sep-G3-His具有优异的吸附选择性和高达28.43mg/g的IgG吸附容量,是较理想的免疫吸附材料。总之,本研究探索了一种简单、高效、可控的方法来设计和制备更安全、更有效、更经济的免疫吸附材料。该方法不仅能克服常规制备法固有的缺陷,还能提高免疫吸附材料的偶联效率和吸附性能。研究结果为新型免疫吸附材料的设计、制备以及在IgG分离和血液净化方面的应用奠定了坚实的理论和实验基础,可望产生极大的社会效益和经济效益。
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