苹果(Malus domestica)是世界上栽培面积最大的果树之一,其果实酸甜可口,色泽鲜艳,具有极高的经济价值。目前苹果成熟期较为集中,为了保证周年供应大多数品种的苹果采摘后都需要保存于不同条件下以保鲜,而后分批取出售卖,所以对其贮藏过程中成熟的调控直接影响了苹果果实的经济价值。苹果果实是一种典型的呼吸跃变型果实,乙烯直接调控果实的成熟期及贮藏性。研究苹果果实成熟过程中乙烯的合成,对人工调控苹果果实成熟期、提高果实的贮藏性有着重要的意义。乙烯合成的调控是一个复杂的生理过程,受到植物体内许多激素及转录因子的调控。生长素作为植物生长发育中不可或缺的激素,近年来园艺领域研究中有报道指出生长素能够影响果实乙烯的合成及果实的成熟。但是生长素调控果实乙烯合成及果实成熟的分子机理却仍不清楚。本研究以‘金冠’苹果为试材,以化学性质稳定、人工合成的生长素类似物萘乙酸(naphthaleneacetic acid,NAA)作为试剂处理苹果果实。结果表明NAA在果实不具备自然后熟能力(贮藏过程不发生呼吸跃变)的时候就能够诱导苹果果实乙烯的产生,开启果实的成熟进程。通过转录组测序筛选到了一个差异表达的生长素响应因子MdARF5。通过染色质免疫共沉淀、酵母单杂交等方法证明了MdARF5可以通过直接促进乙烯合成基因MdACS3a、MdACS1和MdACO1的表达来诱导乙烯合成,进而促进苹果果实成熟。主要研究结果如下:1.对花后145 d(果实成熟期)采收的苹果果实进行NAA处理,室温贮藏20 d。结果显示生长素能够促进苹果果实贮藏过程中乙烯合成相关基因的表达从而促进果实的成熟及乙烯的合成。2.为了研究生长素从何时开始可以促进果实的成熟,苹果果实从花后55 d开始,每30 d采样一次并进行NAA处理。结果发现生长素在花后115 d,果实还不具备自然成熟能力(贮藏过程中不发生呼吸跃变)时就可以显著诱导MdACS3a、MdACS1和MdACO1的表达并诱导乙烯的产生及果实成熟。3.对采收于花后115 d,对照5 d及NAA处理5 d的果实进行转录组测序分析,共检测到了5个差异表达的MdARF,qRT-PCR结果表明虽然所有MdARF的表达都受到NAA处理的促进,但是只有MdARF5的表达模式与果实的乙烯生成趋势相同。4.为了明确MdARF5对果实成熟的调控作用,在苹果果实中利用农杆菌介导的瞬时表达系统沉默及过表达了MdARF5。结果显示与对照果实相比,MdARF5沉默的果实对生长素的响应受到了抑制,乙烯生成量显著降低,乙烯合成相关基因的表达也显著降低。相反,过表达MdARF5则能够促进果实乙烯的产生,诱导了乙烯合成关键基因的表达。5.为了明确MdARF5对乙烯合成基因的调控,利用免疫共沉淀、酵母单杂交、EMSA试验证明了MdARF5能够结合MdACS3a、MdACS1和MdACO1的启动子。GUS活性试验证明MdARF5对它们的启动子起转录激活作用。6.转录组数据的挖掘过程中检测到了一个差异表达的乙烯信号转导基因MdERF2。利用qRT-PCR分析其表达发现NAA处理显著促进了MdERF2的表达。免疫共沉淀、酵母单杂交等试验发现MdARF5能够结合乙烯响应因子MdERF2的启动子。GUS报告基因活性试验表明MdARF5正调控MdERF2启动子的活性。7.由于MdARF5和MdERF2均能调控乙烯合成基因MdACS3a和MdACS1,因此利用GUS活性试验研究它们二者共同对乙烯合成的调控。结果显示MdARF5与MdERF2共同促进了MdACS3a启动子的活性,然而MdERF2抑制了MdARF5对MdACS1启动子的正调控效应。8.通过对花后95 d采收并利用NAA处理的苹果果实的乙烯生成量及基因表达进行测定,发现只有MdACS3a开始表达之后生长素才能诱导果实乙烯的产生。进一步检测MdACS3a表达前后启动子甲基化水平的变化,发现MdACS3a表达后其启动子上的甲基化水平显著降低,并且其启动子甲基化不受到生长素处理的影响。综上所述,生长素能够通过三条途径调控苹果果实乙烯的产生及果实的成熟:MdACS3a启动子去甲基化且MdACS3a的表达开始启动之后,被生长素正调控的MdARF5一方面能够直接结合在MdACS3a启动子上并促进其表达;另一方面MdARF5通过结合在MdERF2启动子上促进MdERF2的积累,再由MdERF2促进MdACS3a的积累,间接地增强MdACS3a的转录;第三,MdARF5还可以直接结合在MdACS1和MdACO1的启动子上,正调控它们的表达,从而促进乙烯的合成。当MdACS1的转录被诱导时,MdERF2则抑制其活性,从而缓冲果实成熟中乙烯的合成。