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目的 1. 研究呼吸道鲍曼不动杆菌Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System, T6SS)的流行情况及其溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein, Hcp)基因的表达与细菌耐药及感染的相关性. 2. 探讨THP-1细胞、A549细胞及pH值对临床鲍曼不动杆菌Hcp基因表达的影响. 3. 构建pET-28a(+)-hcp原核表达系统,探索Hcp蛋白表达的最佳条件并表达纯化Hcp蛋白. 4. 研究Hcp蛋白在巨噬细胞炎症反应中的作用. 方法 1. 筛查Hcp基因在呼吸道鲍曼不动杆菌中的存在情况并检测其表达情况 收集我院2016年6月-2016年9月住院患者呼吸道中分离的鲍曼不动杆菌77株,剔除同一患者同次住院的重复菌株.用PCR技术筛查鲍曼不动杆菌T6SS的关键基因—Hcp基因.对携带Hcp基因的菌株判断定植或感染状态,登记药敏信息,通过qRT-PCR对这些明确定植或感染状态的分离株及ATCC17978标准菌株进行Hcp基因mRNA水平的检测. 2. 影响Hcp基因表达的因素 抽选取若干株分离株感染THP-1细胞,4h和8h后收集菌体,qRT-PCR检测Hcp基因表达量的变化,A549细胞也在感染后做同样处理;抽选若干株分离株,使其分别在pH=5和pH=7的LB培养基中培养3h,qRT-PCR检测Hcp基因表达量的变化. 3. 构建pET-28a(+)-hcp表达载体 构建Pjet1.2-hcp克隆载体表达菌,从大肠杆菌中提取Pjet1.2-hcp克隆载体及pET-28a(+)质粒,分别经XhoⅠ和NcoⅠ限制性内切酶进行双酶切,T4 DNA 连接酶连接后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞.采用菌落PCR和质粒双酶切鉴定重组菌,测序验证Hcp基因序列的正确性. 4. Hcp蛋白的诱导表达及纯化 初步诱导含有 pET-28a(+)-hcp的 E. coli BL21(DE3)使其表达Hcp蛋白,了解该蛋白的表达情况;在不同的时间和IPTG浓度下对重组菌进行诱导,探索目的蛋白表达的最佳IPTG浓度和时间;大量诱导Hcp蛋白的表达,经SDS-PAGE分析该蛋白的主要表达方式;采用His标签蛋白纯化试剂盒(镍柱试剂盒)纯化破菌后的上清蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定. 5. Hcp蛋白引起巨噬细胞炎症因子的表达 分别用25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,300μg/ml,500μg/ml的Hcp作用THP-1巨噬细胞24h,收集细胞,qRT-PCR检测炎症小体通路中NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κBp65、IL-1β、IL-18及IL-8的mRNA水平,实验设培养基空白对照组、空载体菌纯化物和洗脱液三个对照组,排除内毒素及洗脱液成分可能带来的影响. 结果 1. 筛查Hcp基因在呼吸道鲍曼不动杆菌中的存在情况并检测其表达情况 (1)77株呼吸道鲍曼不动杆菌,携带Hcp基因60株,携带率77.9%.MDRO组该基因携带率高达87.1%,MDRO组与非MDRO组之间Hcp基因携带率的差异无统计学意义(χ2=7.25,P=0.075>0.05);多重感染组和单纯感染组之间Hcp基因携带率的差异无统计学意义(χ2=7.29,P=0.692>0.05). (2)60株Hcp基因阳性的分离株中,正确判定31例感染菌,22例定植菌.在这53例分离株中,有17株Hcp基因的表达量小于ATCC17978,有36株Hcp基因的表达量大于ATCC17978,分别将其命名为高表株和低表株,高表株和低表株之间Hcp基因的表达量差异有统计学意义(z=-5.831,P<0.0001);MDRO组Hcp基因的表达量高于非MDRO组,差异有统计学意义(P=0.029<0.05);感染组Hcp基因的表达量高于定植组,差异有统计学意义(P<0.001). (3)β内酰胺类(头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶和头孢吡肟)、喹诺酮类(环丙沙星和左氧氟沙星)、碳青霉烯类(美罗培南)、四环素及替卡西林/棒酸的耐药株的Hcp基因的表达量高于非耐药株该基因的表达量,差异有统计学意义(P<0.05). 2. Hcp基因表达的影响因素 (1)与感染前相比,低表株感染THP-1细胞4h后,Hcp基因的表达量均明显升高,差异有统计学意义(P38<0.01,P45<0.05,P55<0.001);高表株感染THP-1细胞8h后,Hcp基因的表达量均明显升高,差异统计学意义(P16<0.01, P50<0.05,P59<0.01);ATCC17978在感染THP-1细胞4h或8h后,Hcp基因的表达量均明显升高,差异有统计学意义. (2)与感染前相比,高表株、低表株和ATCC17978在感染A549细胞4h或/和8h后,Hcp基因的mRNA水平明显升高,差异有统计学意义. (3)与pH=7的条件相比,Hcp基因的表达量在pH=5的条件下明显升高,差异有统计学意义. 3. pET-28a(+)-hcp表达载体的构建 以pET-28a(+)-hcp重组质粒为模板的PCR产物经电泳分析,在500bp左右出现预期大小的条带,pET-28a(+)-hcp经XhoⅠ和NcoⅠ双酶切也得到了与目的基因大小相符的条带,测序结果在NCBI BLAST中比对,与GenBank:ACX60_11670相似率达100%. 4. Hcp蛋白的诱导表达及纯化 SDS-PAGE分析发现Hcp蛋白以包涵体表达及上清表达的量相当,表达的最佳条件为 37℃,0.5 mmol/L IPTG 诱导5-7h.Ni-NTA亲和层析纯化后的蛋白经Western blot鉴定,在PVDF膜上的19kD 左右处出现与抗-His抗体结合的特异性条带. 5. Hcp蛋白引起巨噬细胞炎症因子的表达 ASC、IL-1β、IL-18 mRNA的表达量只有LPS阳性对照组较其余三个对照组明显增加,差异有统计学意义;Caspase-1和NF-κBp65 mRNA的表达量,LPS阳性对照组和500μg/ml组较三个对照组明显增加,差异有统计学意义;IL-8 mRNA的表达量,LPS阳性对照组和不同浓度组较三个对照组明显增加,差异有统计学意义,且随着Hcp蛋白作用浓度的增加,IL-8的表达量增加,差异有统计学意义. 结论 1. T6SS在呼吸道鲍曼不动杆菌中广泛存在,耐药、混合感染等临床因素不影响T6SS的存在与否. 2. β内酰胺类、喹诺酮类、碳青霉烯类、四环素及替卡西林/棒酸等抗菌药物的耐药使Hcp基因的表达量升高. 3. Hcp基因在感染株中表达突出,可能是鉴别鲍曼不动杆菌定植或感染状态的分子标志. 4. THP-1细胞、A549细胞及酸性环境上调Hcp基因的表达. 5. 成功构建了Hcp蛋白原核表达系统,优化了Hcp蛋白的表达条件并得到该蛋白的纯化物. 6. Hcp蛋白刺激巨噬细胞Caspase-1、NF-κBp65和IL-8 mRNA的表达.