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水稻白叶枯病是一种世界性水稻细菌性病害,对水稻生产以及粮食的安全都造成了严重危害,因此对水稻抗病相关机制的研究尤为重要。本实验室前期已证明了OsmiR1858a超表达株系显著提高了对白叶枯病的抗性,它的剪切靶基因为OsHIN1(Harpin-induced 1 domain containing protein),超表达OsHIN1的水稻植株减弱了对白叶枯的抗性,而RNAi和敲除突变体则正好相反。这些结果证明OsHIN1负调控水稻对白叶枯病的抗性,但机制不详。因此,对OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机制进行探索非常必要。OsHIN1为未知功能蛋白,为了明确它可能的作用网络,拟通过鉴定OsHIN1表达特点、亚细胞定位与鉴定它的互作蛋白,为阐明OsHIN1负调控水稻白叶枯病中的机制提供线索。主要研究结果如下:(1)克隆2kb OsHIN1启动子,构建了pOsHIN1::GUS表达载体并遗传转化水稻,经PCR检测筛选获得12株独立转基因株系(已经获得T1代种子)。对转基因水稻GUS染色结果表明,GUS在水稻幼嫩部位表达较多,成熟部位较少;在叶节点、根茎结合部、根毛等分生组织旺盛部位发现强的GUS表达。对同一株系接种白叶枯病菌P6和模拟接水,3 d后取样染色,发现相同部位中GUS在接种P6后的表达强于模拟接水植株。(2)利用35S::eGFP::OsHIN1载体与定位于质膜Marker(mCherry)共转化水稻原生质体,经激光共聚焦显微镜(confocal)观察发现OsHIN1定位于细胞质膜。(3)经农杆菌介导的水稻胚法进行遗传转化,经PCR检测获得10个35S::OsHIN1:eGFP转基因株系与1个35S::eGFP转基因株系,为后续通过免疫沉淀鉴定互作蛋白提供材料基础。(4)利用P6接种水稻3 d后样品,构建了酵母膜蛋白文库,用OsHIN1::BD筛选酵母文库,获得27个阳性克隆。经分析筛选确定了12个靶基因进行酵母双杂交(片段)一对一验证,其中7个候选基因再次显示阳性。在此基础上,克隆这7个基因的CDS序列,分别经酵母双杂交(全长)和双分子荧光互补验证,胆碱磷酸酶在酵母和本氏烟中均显示与OsHIN1互作,另有4个蛋白与OsHIN1在本氏烟中互作,但在酵母中不互作。