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目的:本研究通过建立大鼠弥漫性脑损伤（Diffuse brain injury,DBI）模型,对海马区及血清中GFAP、C3d、S100A10、CEBPD的相关蛋白、基因表达进行检测,观察A1/A2型星形胶质细胞（A1s/A2s）在DBI后随时间表达的变化,以期为法医学领域中脑损伤时间推断提供新的思路,并且为脑损伤机制的研究提供一定的理论依据。方法:健康雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠96只,200～220g,8周龄,随机分为正常对照组（Normal Control group,NC组,12只）和实验组（84只）,根据大鼠脑损伤后存活时间将实验组分为DBI后4h、8h、12h、1d、3d、5d、7d组,实验包括HE、免疫组织化学染色、免疫荧光双重染色、酶联免疫吸附实验（Elisa）以及实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）。1.根据marmarou方法[1]采用改良的自制颅脑损伤打击装置,制造弥漫性脑损伤模型,采用longa[2]评分法对脑外伤后的大鼠神经功能损伤程度进行评价,并通过HE染色,初步观察脑组织病理学改变,以此判断大鼠造模是否成功。2.通过免疫组织化学染色、免疫荧光双重染色、q RT-PCR实验对各组大鼠脑组织海马区GFAP、C3d、S100A10、CEBPD蛋白、基因表达情况进行检测;Elisa对血清中GFAP、C3d、S100A10蛋白表达情况进行检测,综合分析DBI后大鼠脑组织A1s、A2s及相关蛋白、基因的表达变化。结果:1.行为学检测结果:大鼠在打击后出现大小便失禁、呼吸节律紊乱以及不同程度的肢体抽搐（后肢抽搐显著）,并出现去皮层强直现象,前肢屈曲、后肢强直,角膜反射、疼痛反射、外耳道刺激反射和翻正反射均消失,30min内意识逐渐恢复,可自行爬动,行走时向一侧转圈或倾倒。2.病理学检测结果示:正常对照组大鼠脑组织未见明显异常,结构清晰,细胞排列有序,海马区锥体排列层次清晰,结构完整,胞体淡粉红色,呈圆形或锥形分布,胞核淡蓝色,呈类圆形。小血管周围间隙正常,未见变性坏死的神经细胞及水肿现象。与对照组大鼠相比,实验组大脑、小脑、脑干可见局部蛛网膜下腔出血,蛛网膜下腔散在分布大量红细胞,并伴有少量炎细胞反应及纤维蛋白渗出,部分伴有局灶性浅表性脑挫伤,侧脑室、脑室内脉络丛也可见出血并伴少量炎细胞浸润。部分实验动物在大脑皮质、皮质下脑白质、脑干、小脑及近海马区脑实质内可见散在分布的点、灶状脑挫伤出血,挫伤灶周围伴炎细胞反应,小胶质细胞反应性增生,并可见噬神经细胞现象和卫星现象。挫伤灶周围还可见不同程度神经元变性,早期脑皮质神经元改变不明显,主要表现为神经元肿胀,着色浅淡;随时间进展,可进一步发展为神经元胞核固缩并偏位,胞体固缩,树突与基底间胞界内陷,极化或呈不规则状,胞浆嗜酸性增强,尼氏小体消失,呈红色神经元改变,部分细胞核溶解消失,仅残存细胞轮廓。神经胶质细胞胞体肿胀,并出现胶质细胞增生现象。小血管周围间隙增宽,间隙内可见蛋白水肿液。海马钩回区蛛网膜下腔出血,海马及周围区域神经元变性,并可见不同程度神经细胞坏死,锥体细胞结构紊乱,排列疏松,神经元细胞数量减少,小血管周围间隙增宽,并可见蛋白水肿液。以上结果表明,大鼠脑组织损伤后具有DBI的特征,且DBI后12h海马区神经元变性开始明显,以1d左右最为显著,细胞核固缩深染,胞浆嗜酸性增强,甚至出现胞膜破裂、细胞解体消失,小血管周围间隙显著增宽等脑水肿现象,DBI后3d组神经元坏死减轻,水肿减轻,7d时逐渐恢复。3.免疫组织化学染色结果示:与正常对照组相比,GFAP、C3d、CEBPD在DBI 4h后表达均上升,其中,CEBPD在DBI后12h左右达到峰值,GFAP、C3d于伤后1d左右达到高峰,随后表达呈下降趋势,7d仍高于正常对照组,差异有统计学意义,P＜0.05;而S100A10蛋白普遍存在于正常大鼠海马区,损伤4h后表达下降,1d左右降至最低,1d～7d逐渐升高。差异有统计学意义,P＜0.05。4.免疫荧光双重染色结果示:正常状态下,大鼠海马区星形胶质细胞大部分以A2s形式存在,A1s较少。致伤后A1s、A2s均呈单峰表达模式,且趋势相反,在致伤后1d左右表达分别达到峰值和谷峰。DBI后4h～1d,A1s表达呈上升趋势,1d左右达高峰,1d～7d逐渐下降,7d时仍高于正常对照组,差异有统计学意义,P＜0.05;而A2s与A1s表达趋势相反,DBI后4h～1d,A2s逐渐降低,1d左右表达最低,1d～7d逐渐升高,差异有统计学意义,P＜0.05。星形胶质细胞中CEBPD蛋白也呈单峰表达模式,表现为先升高后降低,12h达到高峰值。差异有统计学意义,P＜0.05。5.q RT-PCR检测结果显示:与对照组相比,gfap m RNA于DBI 4h后表达上升,12h左右达到峰值,之后表达逐渐下降,差异有统计学意义,P＜0.05;c3d、cebpd m RNA于DBI 4h后也出现升高的趋势,8h左右达高峰,随后逐渐下降,7d时仍高于正常对照组;差异有统计学意义,P＜0.05;s100a10 m RNA在DBI 4h后表达下降,8h左右表达量最低,随后呈上升趋势,差异有统计学意义,P＜0.05。6.Elisa检测结果显示:与正常对照组相比,GFAP、C3d在DBI 4h后表达呈上升趋势,DBI后1d左右二者表达呈现高峰,后逐渐下降,差异有统计学意义,P＜0.05;而S100A10在DBI 4h后也呈上升趋势,3d左右达高峰,后逐渐下降,DBI后7d仍高于正常对照组,差异有统计学意义,P＜0.05。结论:1.本实验验证,正常脑组织中星形胶质细胞大部分以A2s形式存在,A1s较少,DBI后7d内二者呈单峰表达的时序性变化规律,且趋势相反,于DBI后1d左右分别达到峰值与谷值。2.DBI后脑组织、血清中GFAP、S100A10、C3d的基因及蛋白表达存在先升高后降低的时序性变化规律,对丰富法医学脑损伤时间推断的生物学指标可提供一定的理论依据。3.DBI后脑组织中cebpd基因的迅速表达使得CEBPD蛋白表达增加,均呈先升高后降低的时序性变化规律,分别于8h、12h达到峰值,且与C3d表达呈正相关性,至于其与A1s的关系关系有待进一步研究。