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狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患病,临床大多表现为特异性恐风、恐水,咽肌痉挛、不可逆的脑脊髓炎等。尽管现在可以预防狂犬病,但我国狂犬病报告死亡数一直位居法定报告传染病前列。目前狂犬病没有有效的治疗方法,一旦发病,这种疾病几乎是致命的,对人的生命健康带来严重威胁。近年来对狂犬病的研究取得了一些进展,但对于狂犬病病毒感染发病机理的研究还不透彻。狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)是一种严格的胞内寄生病毒,病毒的整个生命周期需要多种宿主蛋白的参与。因此,探索与病毒生命周期相互作用的宿主蛋白并深入理解其作用机制,将有助于我们解释病毒生命周期,为狂犬病的防治提供新的靶点,为研究高效的口服疫苗奠定基础。最近几年兴起的基于CRISPR技术高通量筛选技术几乎能够对病毒生命周期的所有方面进行系统的研究,可快速寻找参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主蛋白。所以,CRISPR/Cas9技术将会为狂犬病病毒生命周期的进一步探索,靶向药物的设计及治疗提供有力的技术支持。本研究通过使用慢病毒转导的方法在鼠神经瘤母细胞(N2a)细胞上构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系,经过Western Blot验证Cas9基因在N2a细胞上稳定表达,且Cas9切割活力较好;此外,经过CellTiter-Glo试剂检测,Cas9基因表达对N2a细胞增殖活性无影响;接着利用电转化方法对19,674个小鼠蛋白质编码基因的78,637个向导RNA(Guide RNA,gRNA)质粒文库进行扩增,经过二代测序验证,扩增后的质粒文库覆盖率符合要求;然后进一步使用了慢病毒转导系统,在表达Cas9的N2a细胞中表达这些gRNAs,扩增出基于CRISPR系统鼠源全基因组细胞敲除文库,经过高通量测序分析,扩增之后的细胞文库同样具有良好的覆盖率;再经本实验室构建的ERA-GFP狂犬病毒感染基于CRISPR/Cas9鼠源全基因组细胞敲除文库,利用流式细胞分选仪收集GFP阴性细胞,经过5次感染和分选后,分别对每次分选出的阴性细胞进行全基因组测序和生物信息学分析以获得富集sgRNA所对应的候选基因,得到潜在影响狂犬病病毒复制的宿主因子;利用DAVID生物信息网站分析发现这些基因主要集中在细胞的膜组分以及信号转导和细胞分化生物过程。本研究成功构建了表达Cas9蛋白的N2a细胞系以及基于CRISPR系统的鼠源全基因组文库筛选平台,并筛选出调控狂犬病病毒复制的重要宿主基因,为狂犬病病毒生命周期的探索,靶向药物设计和药物治疗提供新的理论依据。