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目的: 1、通过建立C57BL/6小鼠2/3肝切除动物模型,检测Hic-5在肝再生过程中不同时间点的表达变化。 2、研究Hic-5动态变化与肝细胞再生之间的相关关系及可能机制。 方法: 1、选取40只8-10周龄雄性健康C57BL/6小鼠,体重约20-25g,饲养于SPF动物房中。利用分叶顺次肝大部切除技术建立小鼠2/3肝切除后肝再生动物模型。 2、分别于术后0h、12h、24 h、36h、48 h、72 h、120 h、168 h,8个时间点采集血液和肝组织标本,每个时间点5只小鼠。 3、血清学标本采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝切后不同时间点谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的表达变化情况;各时间点肝脏组织行HE染色,观察肝再生情况;采用免疫组织化学技术(IHC)检测各时间点肝细胞Ki-67和肝组织Hic-5的表达情况,分析两者变化趋势之间可能存在的相关关系;以免疫荧光技术(IF)检测各时间点肝组织中Hic-5的表达量变化及分布;采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测肝切后不同时间点Hic-5mRNA及CyclinD1mRNA表达水平,分析两者表达变化之间可能存在的相关关系;以免疫印迹技术(WB)检测肝切后不同时间点小鼠肝脏组织中Hic-5与CollagenⅠ蛋白表达水平变化,分析其变化的相关关系。以上收集的数据用均数±标准差((x)±s)来对数据进行统计学描述,用SPSS19.0统计学软件进行统计分析,组间行单因素方差LSD法分析,相关关系用Pearson相关系数分析法进行分析比较,P<0.05时,其差异具有统计学意义。 结果: 1、各组小鼠均顺利完成2/3肝切除术,术后存活率100%。ALT、AST均于术后开始升高,其峰值位于12h,且与0h相比,差异具有统计学意义,并于术后24 h随时间的推移逐渐降低,于术后168 h恢复至接近0h水平,与0h相比,差异无统计学意义。 2、HE染色见肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,未见明显肝细胞点状、灶状坏死,肝细胞增殖从术后逐渐增多,在36h处于分裂增殖的肝细胞明显增多,且可见大量小核细胞,后随时间的推移,增殖的肝细胞逐渐减少,再生肝脏肝索结构紊乱。 3、肝细胞Ki-67阳性率于0h为(9.58±0.09)%,后随术后时间逐渐升高,于术后36h达到高峰(77.13±1.65)%,与0h比较,差异具有统计学意义,从48 h开始逐渐降低,至168 h为(12.29±0.64)%。Hic-5随时间点的表达情况则出现与肝细胞Ki-67表达相反的趋势,于12 h Hic-5出现表达高峰,后呈先降低再逐渐升高的趋势,表达的最低点位于36h,其光密度值为(3938.27±82.46),与12h比较,差异具有统计学意义,从48h开始Hic-5的表达逐渐加强,至168 h升高达(20075.26±246.64),高于12h水平,Ki-67和Hic-5的表达变化趋势经Pearson相关性分析结果显示两者表达趋势呈现负相关关系。 4、Hic-5免疫荧光的变化趋势与其免疫组化一致,于12h达第一个高峰后呈先降低再升高的趋势,最低点位于36h,其荧光强度为(6491.34±162.07),与12h比较,差异具有统计学意义,于48 h开始逐渐增强,在168 h其荧光强度达(30824.33±609.44),Hic-5荧光表达趋势与Ki-67的表达趋势经Pearson相关性分析结果显示两者表达趋势呈现负相关关系。 5、Hic-5mRNA于术后12h达高峰,后呈现先降低再逐渐升高的趋势,其最低点在术后36 h为(0.19±0.01),与12h相比,差异具有统计学意义,于48 h开始逐渐升高,168h达(1.06±0.03);Cyclin D1mRNA与Hic-5mRNA表达趋势相反,术后呈逐渐升高至峰值后随时间逐渐降低至近0h水平,于术后36h达到最高水平为(2.53±0.12),与0h比较,差异具有统计学意义,两者变化趋势经Pearson相关性分析结果显示两者表达趋势呈现负相关关系。 6、Hic-5蛋白表达与其mRNA变化趋势一致,于术后12h达第一个高峰后逐渐下降,在术后36h达最低水平,其灰度比值为(0.19±0.09),与12h相比,差异具有统计学意义,从48 h开始逐渐增强,至168 h达(0.91±0.16),高于术后12h峰值;CollagenⅠ蛋白表达12h呈高表达状态,后逐渐降低,于36h达到最低值为(0.11±0.04),与12h比较,差异具有统计学意义,后逐渐增高,于168 h达(0.56±0.07),两者蛋白表达变化经Pearson相关性分析结果显示两者表达趋势呈现正相关关系。 结论: 1、小鼠2/3肝切除后,Hic-5动态变化调控肝再生过程,并与肝再生过程存在负相关关系,是肝再生过程中的负性调节基因。 2、在肝再生的诱导期,Hic-5通过表达下调促进肝再生,而在肝再生的后期,Hic-5通过表达上调可能促进细胞的成熟、分化和抑制细胞的过度增殖。 3、Hic-5通过动态调节细胞外CollagenⅠ的合成与降解调节肝再生过程。