猪血凝性脑脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的急性、高度接触性传染病,给我国各地养猪业的发展造成严重威胁。PHEV主要侵害宿主中枢神经系统(CNS)的神经细胞,导致神经系统功能障碍。通常情况下,病毒入侵细胞时会引起细胞的免疫应答反应进而清除病原体以维持细胞稳态。自噬正是一种细胞固有的免疫机制,通过将包含病原体的内含物运送至溶酶体进行降解,进而阻止病原体在胞内复制增殖。然而,人们发现,病毒也能够进化出一些调节机制对抗细胞自噬,并为自身复制提供有利条件。最新研究表明,PHEV能够诱导神经细胞发生不完全自噬进而为自身生存提供便利。木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLP)是多种病毒复制过程中重要的蛋白酶,有研究表明:SARS、PEDV、HCoV和MERS等冠状病毒均可以通过PLP调控自噬体的形成,引起宿主细胞发生不完全自噬并负向调控抗病毒免疫反应。PHEV同属于冠状病毒属,也同样能够引起宿主细胞发生不完全自噬反应,然而PLP在PHEV诱导的不完全自噬过程中扮演怎样的角色,这个问题引起了我们的关注。本研究以PHEV编码的PLP为研究对象,构建PHEV-PLP的真核表达载体pCMV-Flag-PLP,通过在小鼠神经瘤母细胞(N2a)中过表达PLP探索其是否能引起细胞自噬。首先,将pCMV-Flag-PLP转染到N2a细胞中,过表达PLP蛋白,利用western blot方法检测细胞LC3蛋白的表达情况,结果显示实验组中LC3-I向LC3-II的转化趋势明显增强,提示PLP可能引发自噬。然后,共转染pCMV-Flag-PLP与GFP-LC3B质粒,利用免疫荧光染色法检测到实验组细胞中出现GFP-LC3绿色荧光斑点的聚集,并且这个过程呈现时间依赖性,进一步证实PLP能够诱导细胞发生自噬。与此同时,本实验利用western blot法检测过表达PLP后宿主细胞自噬底物蛋白p62及溶酶体标志蛋白LAMP1的表达水平,显示p62蛋白的表达量没有明显变化而LAMP1蛋白的表达量明显增多,结果表明PLP诱导N2a细胞发生了不完全自噬。Beclin1是参与自噬调控的重要蛋白,在自噬体的形成及成熟阶段发挥着重要作用,本研究将Beclin1作为探索PLP诱导细胞自噬机制的主要研究对象。首先,在N2a细胞中过表达PLP后利用western blot方法检测Beclin1的蛋白表达水平,结果显示Beclin1的表达量与对照相比明显上调,初步表明Beclin1可能参与了PLP诱导的自噬过程。据报道,多种病毒通过表达自身特定蛋白与Beclin1发生互作,进而抑制自噬体与溶酶体的融合过程,为自身生存提供有利条件。因此本实验进一步探索PLP是否与Beclin1存在互作关系。随后,构建pCMV-Flag-Beclin1真核表达载体并与pEGFP-PHEV-PLP共转染细胞,在293T细胞中过表达Beclin1及PLP蛋白,利用免疫共沉淀技术检测,结果表明PLP与Beclin1存在互作关系;然后,利用免疫荧光技术检测PLP与Beclin1蛋白的定位分布情况,结果显示二者在细胞中的表达分布呈现明显的共定位现象,以上结果表明,PLP与Beclin1可以在胞内发生互作。上述结果提示,Beclin1参与了PLP调控细胞自噬的过程,但其在PHEV感染过程中发挥怎样的作用并不明确。为阐明这一问题,本研究利用荧光定量PCR和western blot的方法分别从基因转录水平和蛋白表达水平检测PHEV感染细胞对Beclin1的影响,结果发现,随着PHEV感染时间的增加Beclin1表达呈现明显的上调趋势;利用免疫荧光染色技术检测在PHEV感染N2a细胞后Beclin1蛋白的表达定位变化,发现Beclin1和PHEV呈现明显的共定位关系;在N2a细胞中过表达Beclin1后接种PHEV,发现PHEV的复制增殖并未受到显著影响;利用siRNA技术下调Beclin1 mRNA的表达水平,结果显示PHEV的复制增殖明显下降。综上所述,本研究发现PHEV编码的PLP蛋白引发N2a细胞发生不完全自噬,且PLP诱导自噬相关蛋白Beclin1表达并与其发生互作,进而证实Beclin1对于PHEV复制是必要的。故推测PHEV可能通过PLP与Beclin1的相互作用所形成的不完全自噬来维持其自身的复制增殖。本研究为深入阐明PHEV致病机制提供新的思路。