论文部分内容阅读
目的:检测恶性血液病细胞株和白血病患者中miR-143的表达水平及探讨其临床意义,筛选出miR-143低表达的恶性血液病细胞株,并将其作为研究miR-143与靶基因DNMT3A关系的实验对象;构建miR-143慢病毒表达载体,研究其在K562细胞株中对靶基因DNMT3A表达的作用及对细胞增殖、凋亡的影响。方法:应用real-time PCR检测10种恶性血液病细胞株和临床标本中miR-143的表达状态及分析其临床意义;利用分子克隆技术构建miR-143前体慢病毒载体,与包装质粒共转染293T细胞,包装出高滴度的病毒颗粒,将病毒颗粒感染K562细胞,获得稳定表达miR-143的细胞模型,传代培养;采用CCK-8法、克隆形成试验观察过表达miR-143后对K562细胞的增殖情况;AO/EB染色、Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡情况,Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测凋亡率;real-time PCR检测miR-143、DNMT3A、DNMT3B、DNMT1的表达情况;Western-blotting鉴定过表达miR-143后procaspase-3、procaspase-9、DNMT3A、DNMT3B、DNMT1蛋白的表达变化。结果:(1)白血病患者骨髓单个核细胞中miR-143表达明显下调(P<0.05);但miR-143的低表达与白血病患者的年龄、性别、疾病分型、幼稚细胞比例,以及融合基因和染色体异常等因素无明显相关性(P>0.05);化疗缓解后骨髓细胞中miR-143的表达水平比初治时明显上调(P<0.05);临床标本中miR-143的表达与靶基因DNMT3A成显著负相关(r=-0.665,P<0.05)。(2)成功构建了miR-143前体慢病毒载体,real-time PCR及Western-blotting检测证实稳定表达miR-143细胞株的成功建立。(3)CCK-8方法、克隆形成试验及流式细胞仪检测结果显示,过表达miR-143能抑制K562细胞增殖及细胞G1-S转换。(4)AO/EB及Hoechst 33258荧光染色可见细胞凋亡增加,细胞核致密浓染;流式细胞仪检测细胞凋亡率增加;miR-143还有可能促进procaspase-3、procaspase-9的活化,从而促进细胞凋亡。结论:(1)miR-143具有抑癌基因的功能在白血病中低表达。(2)本实验构建了pMAGic 7.1-pre miR-143-GFP、Puro慢病毒表达载体,通过实验证明其可在白血病细胞中有效表达并转变为成熟的miR-143发挥生物学作用,表明此载体转染细胞可用于其功能研究。(3)miR-143在体外通过下调靶基因DNMT3A的表达,能抑制K562细胞增殖及细胞周期G1-S转换,同时促进细胞凋亡。