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研究背景:糖尿病性骨质疏松(Diabetic Osteoporosis,DO)为世界性的健康问题,其发病机理尚不清楚。研究发现,糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3 beta,GSK3β)与糖尿病相关,而TRPM2与胰岛素代谢和钙离子平衡都有密切关系,在TRPM2基因敲除的小鼠GSK-3β的活性发现了改变,提示TRPM2可能通过GSK3β信号通路影响成骨细胞/破骨细胞的增殖分化而改变骨骼的钙平衡从而影响糖尿病性骨质疏松症的发生。本研究通过动物在体实验来揭示TRPM2-GSK3β信号通路在该病中的作用机制,具有重要的临床应用前景。研究目的:本研究将通过对TRPM2-GSK3β通路调节的研究,来阐明DO的分子机制,研究成果将丰富和完善DO机制理论,为寻求临床上治疗该类疾病的新靶点提供理论依据和思路,为开发出相应的药物提供依据,具有重要的科学价值和潜在的临床应用前景。研究方法:第一部分:从GEO数据库下载已构建的骨质疏松症血液样本的mRNA表达谱芯片数据集,去除批间差后提取相关表达矩阵,初步验证TRPM2、GSK3β的差异表达,并筛选差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),利用DAVID对差异基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)及通路富集分析(KEGG),结果使用R包进行可视化。第二部分:24只3月龄雌性健康SD大鼠适应性喂养1周,随机分为正常对照组(Control组)、1型糖尿病(DM组)、单纯去势组(ED组)、去势合并1型糖尿病组(ED+DM组),每组6只。ED组进行双侧卵巢切除法制作骨质疏松大鼠模型,DM组采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法制作糖尿病大鼠模型,ED+DM组进行手术摘除卵巢后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病性骨质疏松模型。各组大鼠分别于12周末麻醉处死后取材,双能X线吸收法(DXA)测定大鼠全身、腰椎及股骨骨密度(BMD),生物力学试验评估腰椎、股骨骨强度,HE染色观察骨组织形态学,免疫组化和ELISA法分别检测股骨组织中及血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表达。第三部分:24只3月龄清洁级雌性健康SD大鼠,随机分为正常对照组(Control组)、糖尿病合并去势组(ED+DM组)、TRPM2抑制剂+糖尿病合并去势组(ED+DM+Clotrimazole组)、GSK-3β抑制剂组+糖尿病合并去势组(ED+DM+AR-A014418组),每组6只。ED+DM组进行手术摘除卵巢后7天后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病性骨质疏松模型;ED+DM+Clotrimazole组建立糖尿病合并去势模型后腹腔注射TRPM2抑制剂克霉唑(Clotrimazole),每周2次;ED+DM+AR-A014418组建立糖尿病合并去势模型后腹腔注射GSK3β抑制剂AR-A014418,每周2次。于12周末采用双能X线吸收法(DXA)测定大鼠全身、腰椎、股骨骨密度(BMD),测量完麻醉处死取材;生物力学机检测腰椎和股骨的弹性模量、弹性载荷、最大载荷、最大应力等指标;HE染色观察骨组织形态学改变;ELISA法检测血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表达;免疫组化法检测股骨中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β的表达。研究结果:第一部分:通过对两个数据集去除批间差后提取表达矩阵后,验证TRPM2、GSK3β的表达,结果显示,TRPM2、GSK3β在骨质疏松患者中表达增高;继续分析差异基因共获得948个DEGs,差异基因主要涉及翻译起始的调节、中性粒细胞介导免疫、对细胞外刺激的反应、中性粒细胞活化、对营养水平的反应、翻译起始、上皮细胞凋亡过程等生物过程,介导细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、翻译因子活性、RNA结合、翻译起始因子活性等分子功能,富集于细胞-基底结;通路富集分析结果则显示差异基因主要涉及cAMP信号通路、癌症中的蛋白多糖、RNA转运、破骨细胞分化、神经营养素信号通路、胰岛素抵抗、胰高血糖素信号通路、HIF-1信号通路、醛固酮的合成和分泌等经典信号通路。第二部分:骨密度(BMD)结果显示,DM组、ED组和ED+DM组BMD均较Control组显著降低(P<0.05),其中ED+DM组下降最为明显;生物力学结果同样显示,同Control组相比,ED组、DM组、ED+DM组的生物力学弹性模量等指标均下降(P<0.05),其中ED+DM组最低;ELISA法测量血清中及免疫组化染色测量骨组织中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达量结果显示,相比于Control组,DM组及ED+DM组TRPM2、p-GSK3β无论在骨组织还是血清中表达均上调(P<0.05),其中ED+DM组表达最高,且显著高于DM组(P<0.05),ED组则表现为表达下调(P>0.05),而GSK3β蛋白在各组的血清中表达无明显的差异(P>0.05),而在骨组织中表达则与p-GSK3β表达趋势一致,ED组下调,ED+DM组和DM组表达上调,其中ED+DM组表达最高,且显著高于DM组(P<0.05)。第三部分:骨密度(BMD)结果显示,第12周末时,ED+DM组较Control组BMD显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),ED+DM+Clotrimazole组、ED+DM+AR-A014418组较Control组BMD下降无统计学差异(P>0.05);生物力学结果同样显示,同Control组相比,ED+DM组腰椎及股骨的生物力学指标,如弹性模量、弹性载荷、最大载荷、最大应力等均下降,且具有统计学差异(P<0.05);ED+DM+Clotrimazole组、ED+DM+AR-A014418组较Control组下降无统计学差异(P>0.05);血清ELISA结果显示,血清中TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达量,与Control组相比,ED+DM组TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达上调明显,具有统计学意义(P<0.05),ED+DM+Clotrimazole组TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达量上调无统计学意义(P>0.05),ED+DM+AR-A014418组GSK3β上调无统计学意义(P>0.05),但TRPM2表达量上调仍明显(P<0.05)。而免疫组化结果却显示,与Control组相比,ED+DM组TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达上调明显,具有统计学意义(P<0.05),ED+DM+Clotrimazole组TRPM2、GSK3β、p-GSK3β表达量上调无统计学意义(P>0.05),ED+DM+AR-A014418组GSK3β、p-GSK3β上调无统计学意义(P>0.05),TRPM2表达量上调仍明显(P<0.05)。结论:单纯去势组大鼠的骨形态学变化主要表现为骨小梁数量的减少和缺失,而糖尿病组表现为骨小梁厚度明显变细且多数断裂,去势合并糖尿病组则表现为骨小梁数量明显减少,骨质破坏及丢失程度最严重。而ED+DM+Clotrimazole组、ED+DM+AR-A014418组却表现为骨小梁稍变细、无明显断裂。TRPM2、GSK3β、p-GSK3β在ED组、DM组和ED+DM组大鼠中表达均具有显著差异,且TRPM2和GSK3β的抑制剂可以延缓糖尿病性骨质疏松的进程进展,这提示TRPM2、GSK3β可能是糖尿病性骨质疏松的关键病理机制。TRPM2和GSK3β之间存在调控关系,糖尿病可能通过上调TRPM2,导致p-GSK3β上调,GSK3β活性发生变化,进而导致骨质疏松,TRPM2-GSK3β可能是导致糖尿病性骨质疏松症的关键机制。