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目的:研究桂附地黄丸对衰老大鼠回肠干细胞增殖分化稳态的调节作用,并探讨其可能的作用机制。方法:(1)SPF级雄性SD大鼠,6月龄15只为青年组、22月龄45只随机分为衰老组及桂附地黄丸低、高剂量组,每组15只。根据仲景桂附地黄丸(浓缩丸)说明书上成人每天推荐剂量,以及人和大鼠体表面积比值,换算成大鼠的等效剂量,确定各组大鼠每日给药低剂量为0.4 g/kg,以大鼠每日给药低剂量的4倍为高剂量,即1.6 g/kg。给药组大鼠从18月龄开始灌胃给药,给药频率为1次/d、每周给药6天,持续4个月,至其22月龄。青年组及衰老组大鼠分别自2月龄、18月龄给予相应量的生理盐水灌胃,灌胃频率为1次/d、每周灌胃6天,持续4个月,分别至其6月龄和22月龄。(2)HE染色法观察各组大鼠回肠形态学变化情况,并测量相关指标。(3)免疫组织化学染色和RT-PCR法检测各组大鼠回肠干细胞增殖情况。(4)RT-PCR和免疫组织化学染色法检测各组大鼠回肠Wnt/β-catenin信号通路相关因子表达量的变化情况。(5)阿利新蓝染色、PAS染色及碱性磷酸酶组织化学染色法检测各组大鼠回肠干细胞向两种终末型(分泌型和吸收型)上皮细胞分化情况。(6)免疫组织化学染色和RT-PCR法检测各组大鼠回肠Notch信号通路相关因子表达量的变化情况。结果:(1)苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色结果显示:青年组大鼠回肠绒毛高度、隐窝深度适中,与青年组比较,衰老组大鼠回肠绒毛增长,隐窝加深,绒毛长度与隐窝深度的比值(villus length/crypt depth,V/C值)减小;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠绒毛长度、隐窝深度均有所降低,V/C值增大。(2)免疫组织化学染色结果显示:细胞核增殖抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)阳性表达呈棕黄色,位于回肠组织隐窝内,与青年组比较,衰老组大鼠回肠PCNA表达量显著增加;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠PCNA表达量明显减少。RT-PCR结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠干细胞标记物多梳环指结构癌基因1(Bmilpolycomb ringfinger oncogene 1,Bmi1)、富含亮氨酸的G蛋白偶联受体5(Leucine-rich-repeat-containing G-proteincoupled receptor-5,Lgr5)、人类嗅素蛋白4(Olfactomedin 4,Olfm4)m RNA相对表达量显著增加;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠干细胞标记物Bmi1、Lgr5、Olfm4 m RNA相对表达量明显降低。(3)Wnt2b、Wnt3是Wnt/β-catenin信号通路的两个重要配体,糖原合成激酶-3β(Glycogen synthetic kinase-3β,GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信号传导过程中的两个关键蛋白,RT-PCR结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠Wnt2b、Wnt3 m RNA表达水平显著上调;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠Wnt2b、Wnt3 m RNA表达水平显著下调。免疫组织化学染色结果显示:与青年对照组比较,衰老组大鼠回肠GSK-3β蛋白表达量显著降低,β-catenin蛋白表达量显著升高;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠GSK-3β蛋白表达量明显升高,β-catenin蛋白表达量显著降低。(4)阿利新蓝(Alcian Blue,AB)染色及高碘酸-雪芙试剂(Periodic Acid-Schiff,PAS)染色结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠绒毛及隐窝处两种杯状细胞数目均显著增加;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠绒毛及隐窝处杯状细胞数目明显减少。肠道碱性磷酸酶(Intestinal alkaline phosphatase,IAP)在肠道内特异性表达于吸收型肠上皮细胞,可反映吸收型肠上皮细胞分化情况,IAP组织化学染色结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠IAP含量显著降低;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠IAP含量有所增加,但仅桂附地黄丸低剂量组具有统计学意义。(5)Notch受体胞内结构域(Notch receptor intracellular domain,NICD)、丝状分裂增强因子1(Hairy and enhancer of split 1,Hes1)、碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Atonal BHLH transcription factor1,Atoh1)Atoh1是Notch信号通路发挥作用的关键分子,Cleaved-Notch1是Notch1型受体胞内活性结构域。免疫组织化学染色结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠Cleaved-Notch1、Hes1蛋白表达量显著降低;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠Cleaved-Notch1、Hes1蛋白表达量均有不同程度升高;RT-PCR结果显示:与青年组比较,衰老组大鼠回肠Atoh1m RNA表达水平显著增高;给予桂附地黄丸干预后,与衰老组比较,桂附地黄丸各组大鼠回肠Atoh1 m RNA表达水平显著降低。结论:桂附地黄丸可下调衰老大鼠回肠Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制衰老大鼠回肠干细胞的过度增殖,维持衰老大鼠回肠干细胞的增殖稳态;桂附地黄丸还能上调衰老大鼠回肠Notch信号通路,促进衰老大鼠回肠干细胞向分泌型肠上皮细胞分化减少、向吸收型肠上皮细胞分化增加,进而调节衰老大鼠回肠干细胞的分化稳态。