大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）是当今世界上最主要的粮食作物和油料作物之一。截至目前,中国是世界上最大的大豆消费国和大豆进口国。2020年,中国大豆的进口量突破一亿吨。在2019年和2020年,中国连续两年发布的中央一号文件中均提到了中国大豆“振兴计划”。由此可见,挖掘我国自主知识产权的高产基因,创制大豆高产新品系,对于发展和提升我国大豆产业有着重要意义。大豆荚果和籽粒的大小是影响大豆产量的主要因素。在植物植株的生长过程中,植物miRNA在调控分生组织特性、叶片极性和开花模式等方面发挥着关键性的作用。其中,植物miR396由其自身MIR396所形成,是一类高度保守的内源性非编码单链结构的小RNA,能够调控其靶基因GRF的表达。相关研究表明,miR396能够调控作物的分蘖、粒型和穗型等,进而直接影响了作物的产量。因此,基因编辑大豆GmMIR396可以作为提高大豆产量的潜在途径。CRISPR/Cas基因编辑技术用于作物育种具有不含转基因成分、育种周期短和定向改良植物性状的优点,本研究以大豆品种中黄302为受体,利用CRISPR/Cas基因编辑技术对GmMIR396进行编辑,获得了增大荚果和籽粒的无T-DNA插入的五突纯合突变体gm-mir396abcdf和gm-mir396bcdfi,创制出具有更大荚果和籽粒表型的大豆种质资源。具体研究内容和结果如下:1.根据相关文献搜索得知,在大豆中存在11个GmMIR396基因家族成员,均以miR396前体的形式存在,长度大约为100-300bp。本研究从中选取了与拟南芥和水稻同源基因最高的6个GmMIR396（GmMIR396A/B/C/D/F/I）作为目的基因。根据miR396靶向GRF的作用位点设计了两个靶点,g RNA1和g RNA2,其中g RNA1靶向GmMIR396A/I,g RNA2靶向GmMIR396B/C/D/F。2.本研究根据两个靶点g RNA1和g RNA2成功构建了CRISPR/Cas基因编辑载体。3.为了快速验证载体的编辑效率,本研究利用大豆毛状根瞬时转化实验验证了CRISPR/Cas基因编辑载体在目的基因靶点处的编辑效率达到了55%。4.本研究通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化实验对大豆品种中黄302进行遗传转化,经过外植体的准备、共培养、恢复培养、两轮筛选培养和伸长培养共获得519株E0代组织培养抗性植株。5.本研究对E0代组织培养抗性植株进行了阳性检测,获得了112株含T-DNA阳性植株,转化效率为21.58%。通过第一代测序技术检测阳性植株编辑位点是否发生突变,结果发现41株阳性植株为目的基因发生敲除突变的编辑植株,统计CRISPR/Cas基因载体的编辑效率达36.6%。6.本研究种植了E1代到E3代突变体植株,筛选无T-DNA插入的纯合突变体,通过比较纯合突变体植株和野生型植株的农艺性状和产量相关性状,包括荚果大小、籽粒大小、叶片和花的大小、单株籽粒数、单株结荚数、单株产量、百粒重、成熟期株高和作物生育期等,最终获得表型明显的无T-DNA插入的两个五突纯合突变体gm-mir396abcdf和gm-mir396bcdfi。7.本研究通过对比五突纯合突变体gm-mir396abcdf和gm-mir396bcdfi植株和野生型植株,结果显示突变体植株的荚果和籽粒相较于野生型植株明显增大;突变体植株的单株籽粒数、单株结荚数、单株产量、百粒重、成熟株高和作物生育期相较于野生型植株明显增加;突变体植株的叶和花相较于野生型植株明显增大。8.本研究通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）分析了五突纯合突变体gm-mir396abcdf和gm-mir396bcdfi植株和野生型植株叶片中的GmGRF1表达量,结果发现突变体植株中GmGRF1表达量相较于野生型植株显著上升,这表明大豆中miR396可能会通过调控GmGRF的表达进而影响植株的大小。通过以上研究得出结论,可以通过CRISPR/Cas基因编辑技术编辑GmMIR396获得增大荚果和籽粒的五突纯合突变体gm-mir396abcdf和gm-mir396bcdfi,创制出具有更大荚果和籽粒表型的大豆种质资源。