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细胞周期调控是细胞增殖调节的核心环节，与细胞癌变关系十分密切。周期蛋白（cyclin）—周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）—周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）三者形成一个精密的调控网络对细胞周期进行监督调控。周期蛋白是一族呈细胞周期时相特异性表达的蛋白质，它们都含有一段110个左右氨基酸序列的保守区，称为周期蛋白盒（cyclin box），是周期蛋白的分子结构标志和功能调节区。不同的周期蛋白在细胞周期的特定阶段结合并激活其相应的CDK，形成有活性的全酶复合体（Holoenzyme Complex），是细胞周期的驱动分子。Cyclin-CDK的活性受CKI的抑制，以达到对细胞周期调控的动力学平衡。在哺乳动物细胞中已发现了A—I共12型周期蛋白，它们在细胞周期的不同时相发挥作用。例如在G1期发挥调控作用以cyclin D、C、E为代表，在M期则主要是cyclin A和B，而cyclin A也作用于S期。 G型周期蛋白包括两个家族成员：cyclin G1和cyclin G2，二者在cDNA和氨基酸顺序上分别有60％和53％是相同的，但它们表达的细胞周期时相、组织分布及细胞内定位却不一致。Cyclin G1的表达水平在细胞周期各时相基本一致，而cyclin G2的表达水平随细胞周期波动且在晚S期—早G2期达高峰；cyclin G1在骨骼肌中最丰富，而cyclin G2在小脑组织中表达最高，在骨骼肌中呈低水平；cyclin G1主要定位在细胞核中，而cyclin G2主要定位在细胞质中；在生长抑制信号刺激的B淋巴细胞中cyclin G2的转录水平上调，而cyclin Gl的表达不受影响；cyclin G1在部分骨肉瘤中呈高表达，而cyclin G2在口腔鳞癌组织中低表达。因此，二者在细胞周期中可能具有不同的作用。关于cyclin G1已有研究报道：将cyclin G1 cDNA通过转染实验导入人大肠癌细胞和正常成纤维细胞，发现cyclin G1表达促进细胞增殖，表现为体外培养形成集落变大、变多；该研究还提示，cyclin G1表达可部分补救p21WAF1蛋白对细胞增殖的抑制作用；cyclin G1的作用可能是通过Rb蛋白介导的。但对cyclin G2的功能并没有一个建立在直接实验研究基础上的明确认识。Wykoff等将抑癌基因VHL重新导入已存在该基因缺陷的肾癌细胞，发现转基因诱导表达的一系列靶基因中包括cyclin G2。一般而言，周期蛋白是细胞周期的正调节因子，促进细胞增殖。目前，cyclins的功能及调节机制尚不明确。根据现有研究资料分析，cych cz可能不同于典型的对细胞增殖起正调节作用的周期蛋白，而可能对细胞周期起负性调节作用，抑制细胞增殖。为了验证这一假设，本研究首先应用RT－PCR方法克隆了 cyclin GZ基因 cDNA，并构建了真核表达载体，进一步应用脂质体介导的基因转染技术，以体外培养的肿瘤细胞系Hem细胞和正常细胞系CV入细胞作为受体细胞，进行转基因表达的研究，观察并研究Cy－elm GZ高表达对细胞体外增殖的影响，并应用免疫细胞化学技术对其调节机制进行了初步探讨。 首先，根据美国 NCBI GenBank中已知cyclin GZ基因 cDNA序列设计引物，以人口腔癌前上皮细胞系POE4总RNA的反转录（RT）产物为模板，应用PCR方法扩增得到了1070hP的特异片段，经纯化、酶切、连接到载体pcDNA3的 BamH和 Xba酶切位点上，转化 E．Colt JM109感受态细胞，菌落PCR及酶切鉴定重组阳性克隆，并进行核着酸序列分析，证实所得Cy－elm GZ克隆 cDNA］f匝序和开放阅读框架（Open Reading Frame，ORF）都正确。为了确保cyclin GZ基因与载体的选择性标记基因neo能在受体细胞内从单一转录本翻译表达，我们又进一步将叶＊hQc＊＊A亚克隆至含内部核糖体进人位点八nternal Ribosome Entrysite，IRES)的质粒 pIRESneo的BamH和 BstX酶切位点上，构建了真核表达载体PIRES－GZ。PIngS－GZ中 cyclin GZ的顺序再次经核着酸序列分析确认。在本文中，我们将cyelm GZ cDNA克隆到双顺反子真核表达载体pIRESneo后进行基因转染实验，可确保G418筛选后的生存细胞均表达目的基因。载体PIRESneo带有脑心肌炎病毒的 IRES顺序，IRES将插人的目的基因 cyclin GZ与载体本身的选择性标记基因neo两个ORF隔开，使PIRES－GZ重组质粒在受体细胞内仅产生单一转录本，两种蛋白质同时翻译表达。pIRESneo的应用克服了应用PCDNA3等真核表达载体时目的基因与载体本身的筛选标记基因由于分别独立转录和翻译而不一定同时表达的缺点。 继之，以人宫颈癌细胞系h 及非洲绿猴肾细胞系CV一二为受体细胞进行基因转染实验。应用脂质体介导法将plRES－GZ分别转染至Hem和CV八细胞，在含G418的选择性培养基中培养筛选2周。结果显示：与转染 pIRESneo空质粒的对照组相比，cyclin GZ转基因表达的地 细胞形 ·2·成的集落变少、变小，并出现了细胞皱缩、形态不规则、胞质内颗粒增多、出现空泡等提示细胞衰老的形态学改变，两组形成显著对比。对照组的集落数为76．7。24．8，实验组的集落数为18。10．4，占对照组的23．4％。转染PIRES－GZ的实验组CV入细胞几?