苹果果胶寡糖的分离制备及其活性研究

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本文以苹果皮为原料提取苹果果胶多糖,对酶解后产生的果胶寡糖进行了分离纯化及制备,对得到的寡聚半乳糖醛酸进行ESI-MS分析,并对其活性进行了研究,主要结果如下:1.苹果果胶多糖的提取和理化性质的测定苹果皮经水提取、醇沉、Savage脱蛋白及透析,冷冻干燥得苹果果胶多糖,得率为15.8%;气相色谱测定结果表明苹果果胶主要由GalA、Gal、Rha、Ara、Glc、Xyl六种单糖组成,其相应摩尔比为78.54:6.29:4.71:6.21:2.27:1.98;苯酚-硫酸法测得其总糖含量为91.75%;考马斯亮蓝法测得其蛋白含量2.33%;间羟联苯法测得其糖醛酸含量为76.4%;高效液相色谱法测得果胶甲酯化度为80.7%,乙酰化度为10.6%。2.苹果果胶寡糖混合物的制备和分离纯化苹果果胶多糖经脱脂化得到果胶酸,以果胶酸为底物通过酶解得到聚合度为2-8的果胶寡糖混合物,运用阴离子交换柱层析对果胶寡糖混合物进行了分离制备。结果表明,以果胶酸为底物在40℃用果胶酶(EC.3.2.1.15)酶解反应60 min为最佳酶解条件得到果胶寡糖混合物,经分离制备得到聚合度为2~5的寡聚半乳糖醛酸单体,总得率为37%,TLC和ESI-MS检测其纯度为92%以上3.寡聚半乳糖醛酸的ESI-MS分析在对分离后的寡聚半乳糖醛酸进行ESI分析的过程中,我们发现寡聚半乳糖醛酸在离子化过程中易形成一种二聚体,通过与寡聚半乳糖醛酸标准的ESI-MS分析的结果作对比,表明酸性寡糖在离子化过程中都能形成二聚体;二聚体形成后很难解聚,这表现在对二聚体进行MS2时,所需要的碰撞能量大于糖苷键断裂所需要的能量。将寡聚半乳糖醛酸还原后的结果表明,二聚体是以非共价键(氢键)结合而成。4.寡聚半乳糖醛酸的活性分析本实验用MTT法研究寡聚半乳糖醛酸及其与化疗药物5-FU联合用药后对人结肠癌细胞(SW-620)的影响,结果显示,寡聚半乳糖醛酸与肿瘤化疗药物具有协同效应的倾向。利用FCM分析测定细胞周期,结果表明,用寡聚半乳糖醛酸处理后DNA合成期(S期)细胞数明显增加,说明寡聚半乳糖醛酸具有显著地促进人结肠癌细胞(SW-620)进入S期的趋势,使细胞周期阻滞于S期,阻断癌细胞由S期向G2/M期的进程,阻滞细胞的有丝分裂。
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