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鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种寄生原虫病,它由一种或几种球虫在肠道内发生多次的无性生殖和有性生殖所致,给养禽业造成严重的经济损失。目前,公认的鸡球虫有7种,其鉴别,传统方法是根据卵囊形态、寄生部位及病变特征等指标,这费时费力,而且不准确。因此,有必要寻找一种快速、简便、准确的方法来替代,PCR方法可能就是其中的一种。真核生物内转录间隔区(ITS)包括ITS-1区和ITS-2区,具有种间特异性和种内多态性,通过设计特异性引物检测ITS,不仅可以来鉴别形态上难以区分的近缘种,而且还可以用于种内群居间的研究。 巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)为集约化鸡场最常见的3种球虫,因此,我们建立了这3种球虫ITS-1区的多重PCR检测方法,并对10个不同地方株E.maxima的ITS-1序列进行了研究。旨为球虫病的诊断和流行病学调查提供一种快速、灵敏、可靠的检测方法,并从分子生物学方面探讨不同株E.maxima的亲缘关系。 1 堆型艾美耳球虫的分离与鉴定 采用单卵囊分离技术,获得一纯种球虫,鉴定为堆型艾美耳球虫(Eimeria.acervulina)。其主要鉴定指标为:虫体寄生于鸡十二指肠,卵囊呈卵圆形,壁分两层,无卵囊残体,有一极粒,测100个卵囊的平均大小为18.26μm×13.54μm,测100个孢子囊的平均大小为9.48μm×5.15μm,潜在期为97h,最早孢子发育时间为17h。 2 三种鸡球虫多重PCR检测方法的建立 根据GenBank中已发表的E.maxima,E.tenella和E.acervulina ITS-1序列,设计了3对引物,建立了这3种球虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了研究,对PCR反应条件进行了优化,