衰老是一种随着年龄增长、组织细胞老化、器官功能下降引起的不可避免的生理变化过程。 下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体。能够分泌70％的唾液和近50种生物活性物质，且己证实其中许多生物活性物质(如NGF、EGF)是由下颌下腺细胞自身合成、分泌的，对机体多种组织、器官有重要的支持、营养及调节作用。近年来，关于下颌下腺功能的研究逐渐深入，但对其衰老与抗衰老的研究却少有报道。进一步探讨与下颌下腺衰老相关的改变，对于深入了解下颌下腺对机体功能及衰老涎腺功能减退性疾病的影响具有重要意义，有助于理解下颌下腺与某些口腔疾病及消化道功能状况的关系。 细胞衰老过程受控于细胞信号传递系统。衰老对细胞信号传递系统的影响主要表现在对细胞周期进程及与细胞生长增殖相关的转录调控因子功能的影响。Rb/P16转导通路及端粒酶激活是其中的两条重要途径。 本研究采用D-半乳糖衰老大鼠模型，从整体、组织、细胞、蛋白、基因等水平，观察下颌下腺的衰老改变；以NGFmRNA、 EGFmRNA、NGF、EGF 表达的改变观察衰老对下颌下腺细胞分泌功能的影响；初步探讨下颌下腺细胞衰老的信号转导途径以及中药何首乌饮延缓衰老的作用及机制，为下颌下腺的衰老相关性疾病的防治提供理论依据和实验数据，也为进一步研究中药抗衰老的作用机理奠定理论和实验基础。 一、D-半乳糖衰老模型的建立、评价及何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺抗氧化能力的影响 目的 制作D-半乳糖亚急性衰老大鼠模型，检测下颌下腺组织SOD、GStt-PX、T-AOC以及MDA含量的变化，观察其氧化水平和抗氧化能力的改变以及何首乌饮(HSWY)的影响，探讨何首乌饮的抗衰老作用。 方法 1．实验动物的选择和分组 选用8周龄清洁级雌性SD大鼠180只，体重180-220g，将大鼠随机分为两大实验部分，各6组，共12组，每组15只。预防性实验部分：正常组(N)、模型组(M)、何首乌饮预防高剂量组(Ph)、何首乌饮预防中剂量组(Pm)、何首乌饮预防低剂量组(Pl)、何首乌丸预防组(Pw)。 治疗性实验部分：阴性对照组(NC)、自然恢复组(S-R)、何首乌饮治疗高剂量组(Th)、何首乌饮治疗中剂量组(Tm)、何首乌饮治疗低剂量组(Tl)、何首乌丸治疗组(Tw)。 2．药物配方及用法 何首乌饮由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成，何首乌丸由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉组成。 何首乌饮及何首乌丸的给药方法高剂量何首乌饮，3.872克/100g/日，中剂量何首乌饮1.936克/100g/日，低剂量何首乌饮0.968克/100g/日，何首乌丸0.43克/100g/日，分别水煎浓缩成 0.6ml/100g/d，灌胃，每天一次。 3．模型的建立和各组动物的处理方法 D-半乳糖给药方法：D-半乳糖用生理盐水配制成6％的溶液，大鼠称重后按300mg/Kg/d(0.5ml/100mg/d)腹腔注射，每天一次，连续60 天造成衰老动物模型。 预防性实验部分正常组正常喂养60天。模型组腹腔注射D-半乳糖，每天一次，连续60天。其余4组大鼠，作为Ph、Pm、Pl、Pw，从造模的第一天起，在腹腔注射D-半乳糖的同时分别用高、中、低剂量何首乌饮及何首乌丸灌胃，每天一次。60天后预防性实验部分的6个组共同取血、取材。 治疗性实验部分阴性对照组称重后按0.5ml/100mg/d腹腔注射生理盐水，每天一次，连续60天后改为生理盐水灌胃(0.6ml/100g/d)60天。另外5组用D-半乳糖腹腔注射，每天一次，连续60天造成衰老动物模型。取其中4组作为Th、Tm、Tl、Tw，每天分别用高、中、低剂量何首乌饮及何首乌丸灌胃，连续60天。另一组衰老模型作为自然恢复组正常喂养60天。120天后治疗性实验部分的6个组共同取血、取材。 4．衰老模型的评价标准 造模期间每天用电子天平测体重以确定用药剂量，同时观察大鼠毛色、行为等外观特征的改变。第60天局麻下内眦取血，用生物化学方法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)吸光度值的改变。与正常组比较SOD、GSH-PX活力下降， T-AOC减低， MDA 含量升高，差异有统计学意义者，即可确定模型制作成功。 5．下颌下腺组织抗氧化能力的检测 造模成功后，各组大鼠经10％水合氯醛腹腔注射麻醉，摘除双侧下颌下腺、匀浆、离心取上清。用生物化学方法分别检测下颌下腺组织SOD、GSH-PX、T-AOC及MDA的含量。 结论 1．成功地建立了D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠模型。 2．本实验D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠模型组下颌下腺组织SOD、GSH-PX和 T-AOC降低，MDA含量增加的结果表明下颌下腺组织是随衰老发生改变的。 3．何首乌饮可使SOD、GSH-PX的活力明显升高，T-AOC 增强，MDA显著降低的结果说明何首乌饮具有一定抗衰老作用。 二、何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺组织形态学改变的影响目的观察 下颌下腺组织结构、细胞形态及超微结构的衰老性改变以及凋亡相关蛋白表达的变化。探讨何首乌饮对其的影响。 方法 1．定量组织学：制作 HE 染色切片，采用随机点计数立体学方法，光学显微镜下，100点目镜网格，400倍视野，分别计算各视野内的腺实质(包括各级导管及腺泡)、脂肪和纤维间质所占的点数在总点数中所占比例．即表示下颌下腺内各种组织成分的相对体积比。 2．用免疫组织化学方法观察下颌下腺Bcl-2、Bax 蛋白的表达。 3．β-半乳糖苷酶：取新鲜下颌下腺组织，制作冰冻切片，按试剂盒说明书进行β-半乳糖苷酶活性的测定。 4．TUNEL法检测下颌下腺细胞的凋亡情况。 5．透射电镜：大鼠经4％多聚甲醛+2.5％戊二醛灌注固定。取双侧下颌下腺，常规方法制备超薄切片，透射电镜下观察主要细胞器的结构变化。 结论 1．伴随衰老，大鼠下颌下腺组织结构发生明显改变，功能性腺实质成分逐渐减少而被脂肪和纤维间质所替代。何首乌饮可通过抑制下颌下腺组织的纤维性变、脂肪性变而延缓下颌下腺组织结构的衰老性改变。 2．衰老模型下颌下腺Bcl-2表达减少、Bax 表达增加，导致下颌下腺组织中衰老、凋亡细胞明显增多。何首乌饮可通过提高抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达、降低促凋亡蛋白Bax的表达而达到延缓细胞衰老、凋亡的目的。 3．模型大鼠下颌下腺超微结构发生明显衰老改变，何首乌饮可改善衰老大鼠下颌下腺超微结构的衰老变化。 4．上述结果提示老年患者出现口干症状与下颌下腺实质细胞减少、细胞形态改变及超微结构变化导致外分泌功能降低有关。 三、何首乌饮影响D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺功能改变的机理 目的 从分子生物学及细胞水平观察衰老大鼠下颌下腺NGFmRNA、EGFmRNA、及NGF、EGF蛋白表达的改变，探讨衰老对下颌下腺分泌功能的影响及影响层面，以及何首乌饮的作用机制。 方法 1．用SP免疫组化法检测下颌下腺NGF、EGF表达的改变； 2．用原位杂交法观察下颌下腺NGFmRNA、EGFmRNA表达的变化。 结论 本实验结果证实D-半乳糖诱发的大鼠衰老可明显影响下颌下腺分泌生物活性物质(如NGF、EGF等)的功能，其影响的环节在基因转录水平。何首乌饮可在同一基因转录水平提高NGF、EGF 的表达，且以预防用药效果最好。 四、何首乌饮干预D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺细胞信号转导通路的研究 目的 通过检测c-FOS、磷酸化cyclinD1、p16、非磷酸化Rb及端粒酶在下颌下腺组织的表达，探讨下颌下腺细胞衰老信号转导途径及何首乌饮对其的干预作用。 方法 1．用免疫组化法检测c-FOS、磷酸化 cyclinD<,1>表达的改变； 2．用Western blotting法检测p16、非磷酸化Rb表达量的变化。 3．取NC、模型、Pm、Pw、Tm及 Tw 6个组，每组5只大鼠，采用端粒重复扩增．微孔板杂交法检测下颌下腺细胞端粒酶活性。 结论 1．本实验说明D-半乳糖诱发的大鼠下颌下腺细胞衰老与Rb/p16细胞转导通路的阻滞及端粒酶活性降低相关。 2．何首乌饮可通过激活Rb/p16通路及提高端粒酶活性而延缓下颌下腺细胞衰老的进程。