目的:肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,已成为癌症中的第一杀手,严重威胁人类生命健康。每年肺癌新发病例超过100多万,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占80%-85%,而肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。肺腺癌最显著的特征是高度浸润和破坏性生长,它容易侵犯血管和淋巴管壁,进而出现血行和淋巴转移。肺癌的发生发展是由多条信号转导通路调节,多因素参与的复杂过程。如何对肺腺癌实施有效的治疗提高患者生存,已成为目前研究的重点和难点。我们对调控肺腺癌的信号转导通路进行深入的探索,有助于阐明肺腺癌的发病机制,可为其治疗找到新的靶点提供思路。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)由ErbB-1/EGFR、Erb B-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4四大成员组成。这些受体酪氨酸激酶家族成员是一类由膜外的配体结合区、跨膜区和膜内含有酪氨酸激酶活性的功能结构域组成的跨膜糖蛋白。表皮生长因子受体通过与配体(如EGF)结合,从而导致胞内酪氨酸激酶域活化,形成同源或异源二聚体,引起下游多条在细胞的分化、增殖、运动中起重要作用的信号通路(如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等)的激活。其中EGFR(ErbB-1)是此家族中最重要的成员。其过表达及活化与肿瘤的发生、发展密切相关。据研究,EGFR是一种与NSCLC进展和预后不良相关的标志性分子,NSCLC中约40%-80%存在EGFR过表达,因此EGFR已成为一个重要的治疗靶点,目前针对EGFR的靶向药物已应用于NSCLC的治疗,但其单独应用的临床有效率并不高且易产生耐药,这就提示,EGFR信号转导通路的活化可能还受其它多种分子的影响,进而在NSCLC的发生发展侵袭转移的过程中起重要作用,还需要进一步分析研究。小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是小窝蛋白家族中的一员,是细胞质膜表面特异性膜内陷囊泡(caveolae)的重要标志性结构蛋白,广泛存在于各种细胞中,参与多种生命活动。Cav-1分子量21-24kDa,共由178个氨基酸残基组成,其结构特殊,无胞外区,位于中间的高度保守的疏水性区域(102-134氨基酸残基)以发卡结构镶嵌在细胞膜内,从而将该蛋白链分为n末端和c末端两个区,其中主要的功能区域为n端的82-101残基,cav-1不仅主要通过此区域与胆固醇相互作用,而且还与各种信号分子(如egfr)结合,从而调节下游信号通路。近年来cav-1逐渐受到人们的关注,其参与多种细胞的信号转导及增殖、分化和凋亡,对肿瘤的发生发展具有促进和抑制的双重作用。本研究主要探讨cav-1对肺腺癌细胞生物学行为的影响及其调控egfr信号转导通路的分子机制,为肺腺癌的治疗提供新靶点。首先,体外培养各人肺腺癌细胞株,观察其cav-1表达情况;选取cav-1低表达的glc-82细胞株,通过质粒转染技术,上调cav-1的表达;利用mtt增殖实验、woundhealing(划痕修复实验)和transwell侵袭实验观察cav-1对人肺腺癌glc-82细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响;经westernblot检测egfr及其下游通路中各分子的活化水平;体外裸鼠荷瘤实验观察cav-1对glc-82细胞成瘤能力的影响;收集临床标本,通过免疫组织化学法探讨人肺腺癌组织中cav-1的表达与临床病理及预后的关系。本研究分以下三个部分:第一部分cav-1对肺腺癌glc-82细胞生物学行为的影响及机制探讨方法:1westernblot法检测不同肺腺癌细胞中cav-1的表达情况培养不同肺腺癌细胞株glc-82、h1975、a549、h1650和h1299,westernblot法检测各细胞株cav-1的表达水平。2质粒转染建立过表达cav-1的稳定转染细胞株将含人全长cav-1基因的pcdna3.1质粒和空载体质粒分别转染低表达cav-1的人肺腺癌glc-82细胞,经g418抗性筛选,得到过表达cav-1的稳定转染细胞株(glc-82/cav-1)及其对照组细胞(glc-82/pcdna3.1);利用实时荧光定量pcr和westernblot法检测稳转细胞株中cav-1的mrna和蛋白水平。3mtt比色分析法检测转染细胞株的增殖能力将glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1细胞分别接种于96孔板,经不同浓度(0nm、4nm、20nm、100nm)的egf刺激,而后加入mtt,测定各孔吸光度值,检测稳定转染细胞株的增殖能力。4woundhealing实验检测转染细胞株的迁移能力将glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1细胞分别接种于24孔板,用不含胎牛血清的1640培基饥饿4小时后,用10μl移液器吸头进行划痕,并将两种细胞各自分别分为无egf刺激组和20nmegf刺激组,显微镜下观察划痕愈合情况。5transwell法检测转染细胞株的侵袭能力将基质胶铺于transwell小室的上室,将glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1两组细胞分别接种于上室,上室培养液不含胎牛血清,下室培养液含10%胎牛血清,24h后取出小室,95%冰乙醇固定、he染色,显微镜下计数穿膜细胞数。6westernblot检测egfr活化水平及其下游信号通路分子的变化将glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1细胞分别接种于培养皿,用不含胎牛血清的1640培基饥饿4h,再20nmegf刺激,于不同时间点(0min、5min、10min、30min)收集细胞,提取总蛋白;采用westernblot法检测p-egfr及egfr、p-erk及erk的表达水平。结果:1不同肺腺癌细胞株中cav-1的表达情况利用westernblot检测肺腺癌细胞glc-82、h1975、a549、h1650和h1299中cav-1的表达水平(0.12±0.00,1.41±0.00,0.64±0.01,1.11±0.01,1.67±0.00),其中glc-82细胞中cav-1的表达水平是最低的(p<0.01)。2稳定转染肺腺癌细胞株中cav-1水平的检测glc-82/cav-1细胞中cav-1mrna的相对定量值(6.07±0.12)明显高于glc-82/pcdna3.1细胞(0.09±0.01),同时cav-1蛋白的表达量(0.74±0.05)明显高于glc-82/pcdna3.1细胞(0.09±0.01),二者均有统计学意义(p<0.01)。3稳定转染cav-1肺腺癌细胞株的增殖情况经不同浓度(0nm、4nm、20nm、100nm)egf刺激后,利用mtt法检测各浓度od值glc-82/cav-1组(0.68±0.04,0.79±0.05,0.85±0.03,0.96±0.05)均明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.56±0.02,0.64±0.03,0.73±0.02,0.82±0.02),均有统计学意义(p<0.05)。4稳定转染cav-1肺腺癌细胞株的迁移情况采用woundhealing法检测细胞的迁移能力,首先当无egf刺激时,细胞在各时间点的迁移率glc-82/cav-1组(14.01±0.78%,20.70±0.86%,25.23±0.75%,31.96±0.92%,35.07±0.31%)均高于glc-82/pcdna3.1组(7.88±0.81%,14.72±0.97%,18.32±1.50%,23.27±0.27%,26.52±1.39%),均有统计学意义(p<0.05);然后给予20nmegf刺激,细胞在各时间点的迁移率glc-82/cav-1组(21.09±1.32%,28.67±0.94%,33.66±0.64%,42.42±1.43%,50.00±0.00%)则明显高于glc-82/pcdna3.1细胞(10.01±0.80%,16.08±1.01%,21.77±1.51%,28.42±1.49%,34.68±2.27%),均有统计学意义(p<0.05)。5稳定转染cav-1肺腺癌细胞株的侵袭情况采用transwell法检测细胞的侵袭能力,glc-82/cav-1组(71±3)穿膜细胞数明显高于glc-82/pcdna3.1组(38±3),有统计学意义(p<0.01)。6稳定转染cav-1肺腺癌细胞株egfr活化水平及其下游信号通路分子的变化情况采用westernblot检测稳转细胞经egf刺激5min、10min、30min后,cav-1在各时间点的蛋白表达量glc-82/cav-1组(0.96±0.67,1.14±0.14,1.25±0.04,0.83±0.09)均明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00),均有统计学意义(p<0.01);p-egfr在各时间点的蛋白表达量glc-82/cav-1组(1.11±0.19,1.18±0.24,0.43±0.2)均明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.71±0.16,0.63±0.21,0.02±0.12),均有统计学意义(p<0.01);p-erk在各时间点的蛋白表达量glc-82/cav-1组(0.15±0.08,0.16±0.04,0.93±0.09)均明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.14±0.10,0.12±0.04,0.13±0.03),均有统计学意义(p<0.01)。第二部分cav-1对肺腺癌细胞在裸鼠体内成瘤性的影响及其机制研究方法:将glc-82/cav-1和glc-82/pcdna3.1细胞分别接种于5周龄雌性balb/c裸鼠右前肢背部。每组6只裸鼠。调整细胞浓度为1×107/ml,即每只1×106个细胞。每3天观察1次,并绘制肿瘤生长曲线、观察体重变化。8周后处死裸鼠,剥取瘤组织后称重并拍照。一方面,提取瘤组织总蛋白,利用westernblot检测不同瘤组织中cav-1和egfr及其下游信号分子的变化。另一方面,石蜡包埋瘤组织,免疫组织化学法检测cav-1、ki-67和p-egfr的表达情况。结果:1裸鼠模型glc-82/cav-1组裸鼠荷瘤体积明显大于glc-82/pcdna3.1组,且随时间的延长差异越大,有统计学意义(p<0.01)。处死裸鼠后,称取瘤重,glc-82/cav-1组瘤重明显高于glc-82/pcdna3.1组,有统计学意义(p<0.01)。glc-82/cav-1组裸鼠体重稍高于glc-82/pcdna3.1组,但无统计学意义(p>0.05)。2免疫组化检测瘤组织中蛋白表达水平利用免疫组化法检测瘤组织中蛋白的表达水平,glc-82/cav-1组cav-1、p-egfr、ki-67的蛋白表达水平明显高于对照组,有统计学意义(p<0.01)。3westernblot检测瘤组织中蛋白表达水平glc-82/cav-1组cav-1的表达水平(1.09±0.00,1.51±0.00,1.40±0.00,1.48±0.00)明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.02±0.00,0.09±0.00,0.03±0.00,0.03±0.00);p-egfr的表达水平(0.56±0.02,0.77±0.03,0.46±0.04,0.59±0.01)明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.46±0.02,0.33±0.03,0.36±0.01,0.53±0.01);p-erk的表达水平(1.05±0.02,1.24±0.03,1.52±0.02,0.34±0.02)明显高于glc-82/pcdna3.1组(0.21±0.03,0.37±0.02,0.75±0.02,0.22±0.02),差异均有统计学意义(p<0.01)。第三部分cav-1在肺腺癌组织中的表达及其与临床病理特征相关性方法:随机选取的68例手术切除的肺腺癌组织石蜡标本,病例资料完整,采用免疫组织化学第二代聚合酶二步法(pv)检测其cav-1、egfr和ki-67的表达情况。分析研究cav-1在肺腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性。结果:1cav-1、egfr和ki-67在肺腺癌组织中的表达特点cav-1和egfr蛋白在肺腺癌组织中主要分布在细胞膜和细胞质,阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状,胞核不着色。cav-1蛋白阳性表达率为51.5%(35/68),egfr蛋白表达阳性率为52.9%(36/68)。ki-67蛋白在细胞核表达,阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状,阳性表达率为50%(34/68)。2 Cav-1和Ki-67与肺腺癌临床病理特征的关系在68例肺腺癌患者组织中,Cav-1蛋白的高表达与肿瘤分化程度、有无淋巴结转移和临床分期有关,其差异均有统计学意义(P<0.05),但是与年龄、性别和肿瘤大小等无关。Ki-67蛋白的表达与有无淋巴结转移和临床分期有关,其差异均有统计学意义(P<0.05),但是与年龄、性别、肿瘤大小及分化程度等无关。3 Cav-1与Ki-67在肺腺癌组织中表达的相关性Cav-1和Ki-67表达共阳性者23例,共阴性者22例,二者的表达呈正相关(r=0.324,P<0.05)。结论:1体外实验表明上调Cav-1表达可促进肺腺癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力;2裸鼠成瘤实验表明上调Cav-1表达可促进肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力;3 Cav-1通过调控肺腺癌细胞EGFR的磷酸化,影响Ras-Raf-MAPK信号转导通路的活化,进而影响其一系列生物学行为;4 Cav-1在人肺腺癌细胞中的表达促进了肿瘤的增殖,浸润和侵袭。