多杀菌素(Spinosad)是刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)合成的一种天然大环内酯类化合物,具有高效生物杀虫活性。但野生型刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力很弱,因此,利用基因工程技术定向改造刺糖多孢菌的调控基因或关键功能基因以提高多杀菌素产量具有重要意义。聚磷酸激酶基因(ppk)和亮氨酰氨肽酶基因(pep A)均为放线菌中影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断其表达能有效促进次级代谢产物合成。本研究构建了敲除载体p OJ260-ppk和p OJ260-pep A,通过接合转移方法将功能质粒分别导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的基因缺失菌株S.sp-△ppk和S.sp-△pep A。光学显微镜观察发现工程菌株S.sp-△ppk和S.sp-△pep A菌丝片段化程度较原始菌株明显提高。采用高效液相色谱检测多杀菌素生物合成情况,与对照菌株相比,工程菌株S.sp-△ppk多杀菌素产量提高1.19倍,工程菌株S.sp-△pep A多杀菌素产量提高1.37倍。3’-O-甲基鼠李糖是多杀菌素的必要组成成分,同时也是刺糖多孢菌细胞壁的组成要素。为了促进多杀菌素合成关键底物3’-O-甲基鼠李糖的合成,本研究通过接合转移将已构建好的鼠李糖表达载体p JNRM导入刺糖多孢菌中,获得了鼠李糖生物合成基因加倍的工程菌株S.sp-RM。PCR鉴定结果表明,该质粒已成功地整合至刺糖多孢菌染色体上。实时荧光定量RT-PCR检测显示,工程菌中gdh、kre、epi和gtt基因的转录水平较原始菌株分别提高了80.3倍、30.8倍、23.8倍和18.3倍;HPLC检测结果表明,工程菌S.sp-RM中多杀菌素产量比原始菌株提高1.72倍。本研究通过定向遗传改造的方法,成功阻断了ppk和pep A的在刺糖多孢菌中的表达,实现了鼠李糖生物合成基因在刺糖多孢菌菌株中的过表达,有效地促进了多杀菌素的生物合成,证明了此方法的高效可行性,奠定了遗传修饰刺糖多孢菌基因组以提高多杀菌素生物合成的重要基础。