【摘 要】
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目的通过组织块法从人健康的牙髓组织中分离培养人牙髓间充质细胞（human dental pulp mesen-chymal stromal cells,h DPSCs）,体外实验从细胞分子水平首先评估褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力的影响,然后进一步评估在脂多糖刺激模拟的炎症微环境中褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力及炎性细胞因子水平的影响以及潜在的作用机制,为今后褪黑素应用于牙周组织工程提
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目的通过组织块法从人健康的牙髓组织中分离培养人牙髓间充质细胞（human dental pulp mesen-chymal stromal cells,h DPSCs）,体外实验从细胞分子水平首先评估褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力的影响,然后进一步评估在脂多糖刺激模拟的炎症微环境中褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力及炎性细胞因子水平的影响以及潜在的作用机制,为今后褪黑素应用于牙周组织工程提供理论依据。方法1.通过组织块法对因正畸治疗需要而拔除的前磨牙或因无保留价值而拔除的第三磨牙的牙髓组织进行分离培养获得原代人牙髓间充质细胞,通过酶消化法进行细胞传代培养,在显微镜下仔细观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表面抗原标志物。2.研究褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力的影响。通过CCK-8试剂盒检测褪黑素的细胞毒性及对细胞增殖能力的影响;通过碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒定量分析不同浓度褪黑素对细胞中碱性磷酸酶活性的影响;通过碱性磷酸酶和茜素红S染色定性评估褪黑素对细胞成骨矿化能力的影响;通过q PCR和Western blot检测褪黑素对细胞成骨分化相关基因m RNA和蛋白表达的影响。3.研究炎症微环境下褪黑素对人牙髓间充质细胞成骨分化能力及炎症细胞因子水平的影响。采用MTT法检测不同浓度脂多糖对细胞活力的影响;采用ELISA检测不同浓度脂多糖对细胞上清液炎症因子水平的影响;采用CCK-8试剂盒检测褪黑素对脂多糖刺激的细胞的保护作用;通过q PCR和Western blot检测褪黑素对脂多糖刺激的细胞成骨分化相关基因m RNA和蛋白表达的影响;通过q PCR和ELISA检测褪黑素对脂多糖刺激的细胞炎症细胞因子m RNA和蛋白表达的影响;通过q PCR和Western blot检测褪黑素对脂多糖刺激的细胞TLR4/NF-κB信号通路关键因子m RNA和蛋白表达的影响。结果1.显微镜下观察原代及P3代人牙髓间充质细胞为长梭形、呈纺锤状;流式细胞术结果显示细胞表面间充质标志物CD73和CD44为阳性高表达、造血标志物CD45和CD34为阴性表达,符合人间充质细胞的特征。2.CCK-8结果显示褪黑素对细胞增殖无明显的毒副作用;ALP活性定量分析结果表明褪黑素可明显提高细胞碱性磷酸酶活性,且褪黑素浓度为1μM时提高效果最显著（P＜0.05）;碱性磷酸酶和茜素红S染色结果显示褪黑素组碱性磷酸酶表达上升、钙结节形成增多;q PCR结果表明单纯褪黑素组成骨分化基因OCN、OPN、BMP-2和Runx2的m RNA表达水平均上升,且褪黑素浓度为1μM时上升最显著（P＜0.05）;Western blot结果表明1μM褪黑素组OCN和OPN的蛋白表达水平均显著上升（P＜0.05）。3.MTT结果显示脂多糖抑制细胞活力呈剂量依赖性;ELISA结果显示脂多糖提高细胞上清液炎症细胞因子水平呈剂量依赖性;CCK-8结果显示褪黑素可提高由脂多糖抑制的细胞增殖活力;q PCR和Western blot结果显示褪黑素可提高由脂多糖抑制的细胞成骨分化,且褪黑素浓度为10μM时效果最显著（P＜0.05）;q PCR和ELISA结果表明褪黑素可降低炎症微环境中IL-6、IL-1β和TNF-α水平,且褪黑素浓度为10μM时降低效果最显著（P＜0.05）;q PCR和Western blot结表明褪黑素通过抑制由脂多糖激活的TLR4/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用。结论在常规培养条件下,褪黑素具有促进人牙髓间充质细胞成骨分化的作用;在炎症微环境中,褪黑素不仅具有促进人牙髓间充质细胞成骨分化的作用,还可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用,褪黑素对牙周炎具有潜在的治疗作用。
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