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前言关节软骨缺损和退变是骨科常见病、多发病，目前治疗除人工关节置换外尚无其他良策，人工关节置换的高昂费用和并发症不容忽视。组织工程方法修复关节软骨缺损已取得初步成功，但移植后组织工程软骨随时间延长出现老化退变现象，从而制约了其进一步临床应用，老化和退变的主要原因是软骨细胞本身增殖、传代能力差，软骨细胞所具有特异性细胞外基质（extrcellular matrix, ECM）合成减少，从而影响软骨细胞的表型和活性，虽然有报道在细胞培养过程中应用藻酸盐支架和添加细胞因子进行改善，但受到作用时间短、易于流失需反复添加、价格昂贵等因素制约。转基因技术（gene transfer）是指将克隆化的外源基因通过特定的手段导入真核细胞的方法，具有以下优点：1）受体细胞可持续高效地表达目的基因，以调控其自身和其他效应细胞生长并获得所需特定功能；2）转基因细胞合成分泌的内源性蛋白经过适当的翻译后修饰过程，能够更有效地同细胞表面受体结合，表达产物的生物活性更高；3）价格远低于纯化的重组蛋白。因此，若结合应用转基因技术，将能够促进软骨细胞ECM合成的目的基因导入其中，以此为种子细胞构建一种基因修饰的组织工程软骨（gene modified tissue engineering cartilage, GMTEC）无疑非常具有意义。本课题旨在对导致关节软骨退变的原因研究之后，利用转基因技术，以TGF-β1目的基因分别修饰软骨细胞和骨髓间充质干细胞（MSCs），对基因转染后细胞外基质的合成、基质金属蛋白酶（MMPs）及其活性进行研究，在构建新型基因修饰组织工程软骨种子细胞基础上，就基因修饰对细胞外基质影响的机制进行研究，为基因修饰的组织工程软骨的构建和其实际应用奠定实验基础。<WP=7>第一部分 骨关节炎中基质金属蛋白酶1、2、3及其抑制物1、2的表达和意义目的 探讨骨关节炎关节软骨中基质金属蛋白酶（MMPs）1、2、3及其抑制物(TIMPs)1、2的免疫组化表达及与软骨退变的关系。 方法 22例因骨关节炎行关节置换的软骨组织常规HE染色观察其组织学变化，ABC免疫组化法观察关节软骨MMP-1、2、3和TIMP-1、2的表达，经图象分析研究MMP-1、2、3和TIMP-1、2与软骨组织学退变的关系，5例因股骨颈骨折行关节置换的软骨标本为正常对照。结果 骨关节炎关节软骨出现纤维化、裂隙、变薄，软骨细胞数量减少；MMP-1、3和TIMP-1在正常软骨无表达，在中度退变软骨中表达明显升高，在重度退变软骨中表达降低，TIMP-1与MMP-1表达升高不平行；MMP-2和TIMP-2在正常软骨低表达，在中度退变软骨中表达升高，在重度退变软骨表达降低，但TIMP-2表达升高。小结 在骨关节炎中MMP-1、2、3和TIMP-1、2表达异常，引起细胞外基质异常降解，是导致关节软骨发生组织学退变的原因之一。第二部分 TGF-β1转染兔关节软骨细胞促进其细胞外基质合成目的 将TGF-β1目的基因转染兔关节软骨细胞，并研究对细胞外基质、MMP-1,2,3的影响，为构建新型组织工程软骨种子细胞提供实验依据。方法 利用重组DNA和基因克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1，采用脂质体介导法将其转入体外培养的兔关节软骨细胞，经G418筛选阳性克隆，Northern blot法和Western blot法鉴定，对转染后关节软骨<WP=8>细胞的II型胶原(ColII)、纤维连接蛋白（FN）行Western blot 检测，对MMP-1,2,3行Western blot检测MMP-2,3行酶谱活性分析。结果 成功构建重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1并转染兔关节软骨细胞，转染后的第6代、第7代软骨细胞较未转染的第5代软骨细胞ColII、FN含量均明显增高，MMP-1，3合成和MMP-3酶活性降低，MMP-2无明显变化。小结 以脂质体介导法能够将TGF-β1目的基因转染兔关节软骨细胞且建立稳定表达，转染后软骨细胞合成的细胞外基质增多，MMP-1,3合成和MMP-3酶谱活性降低是导致其细胞外基质增多的原因之一。第三部分 TGF-β1基因修饰诱导MSC成软骨分化目的 以TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSC），诱导其成软骨分化，并研究对成软骨分化的特异性细胞外基质以及MMP-1,2,3的影响，为构建新型组织工程软骨种子细胞提供实验依据。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞（MSC），采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1瞬时转染MSC， RT-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的II型胶原(ColII)、纤维连接蛋白（FN）和基质金属蛋白酶－1，2，3（MMP-1,2,3）行RT-PCR和Western blot 检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞（MSC）;；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColII、FN mRNA和蛋白表达明显增强，MMP-1,3 mRNA和蛋白表达量减弱，MMP-2 mRNA和蛋白表达有所增强。<WP=9>小结 以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多，MMP-1,3分泌量减少是导致其成软骨分化特异性细胞?