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表观遗传可以改变基因转录水平,但不会改变DNA序列。近些年,越来越多的科学家投入到5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)的研究中来。短短数年间,难以计数的文章报导了 5hmC的化学结构、分布,功能以及与疾病的潜在关联。5hmC的出现拓宽了我们对表观调控的领域的认识,也为我们寻找结直肠癌相关基因提供新的线索。在本研究中,我们运用甲基化免疫共沉淀测序(DNA immunoprecipitation sequencing,MedIP-seq)和羟甲基化免疫共沉淀测序(Hydroxymethylation DNA immunoprecipitation sequencing,hMeDIP-seq),在 6 对结直肠癌样本中,同步检测了 5mC和5hmC的变化,并运用高通量RNA深度测序(High-throughput sequencing,RNA-seq),探索5mC、5hmC与转录水平之间的关系。之后,我们根据测序结果,选取了甲基化,羟甲基化和表达都有差异的候选基因,在135对结直肠癌样本中,进行mRNA水平的检测,并收集临床病理资料与随访信息,分析候选基因转录水平与临床病理参数以及预后之间的关系。我们的结果显示,5mC和5hmC总体含量在结直肠癌肿瘤组织比在配对癌旁组织中低。但是,在DNA的一些局部区域,例如外显子,CpG岛以及短散在重复序列中,5mC含量是升高的。而5hmC含量在CpG岛岸、外显子以及转录起始位点附近丢失幅度很大。根据肿瘤组织与癌旁组织间5mC、5hmC的分布状况,我们发现了一些甲基化差异区段(differentially methylated region,DMR)和羟甲基化差异区段(differentially hydroxymethylated region,DhMR)。DMR 和 DhMR的分布具有一致性,在基因内部,内含子、基因间隔以及重复序列中富集。肿瘤组织中,甲基化上升区段主要在CpG岛和CpG岛岸,而下降区段主要在重复序列中。羟甲基化上升区段主要在启动子的CpG位点,而在CpG岛岸、增强子和外显子中丢失。根据DMR、DhMR分布差异,以及RNA-seq的结果,我们筛选到一批在肿瘤与癌旁组织中,存在甲基化羟甲基化与mRNA表达差异的基因,并在135例结直肠癌患者的肿瘤与配对癌旁组织中检测mRNA的表达水平,我们发现KIAAK119(0.112 vs.0.020)、SOX9(0.151vs.0.083)在肿瘤组织中表达上升,而AQP8(0.005 vs.0.238)、BEST4(0.004 vs.0.282)、MAL(0.014 vs.0.194)和ADH1A(0.045 vs.0.713)在肿瘤组织中表达下降,结果具有统计学意义(中位表达水平;肿瘤组织vs.配对癌旁组织;P<0.05)。我们进一步分析这些基因转录水平和临床病理资料之间的关联,发现,KIAA1199表达在大于60岁的人群中较高(0.13vs.0.10;P=0.06),AQP8在Duke’s分期C和D期的患者中比A和B期表达高(0.003 vs.0.008;P<0.05),BEST4(0.005 vs.0.003;P=0.06),MAL(0.012 vs.0.007,P<0.05)和ADH1A(0.071vs.0.021;P<0.05)均与肿块大小相关,在直径小于5cm的肿块组织中表达较低。其余包括TNM分期,组织学类型、分化、浸润、淋巴结转移等临床病理指标,均为得到统计学意义上的差异(P>0.05;Kruskal-Wallis检验)。运用Kaplan-Meier生存分析后,发现这些基因的mRNA表达变化与患者预后存在关联,肿瘤组织中,高表达这些基因的人群,预后较差,结果具有统计学意义,其中,KIAA1199(P=0.027)、,SOX8(P=0.043)、AQP0.033)、BEST4(P=0.004)、MAL(P=0.045)和ADH1A(P=0.001)。总结而言,本研究发现结直肠癌中存在甲基化和羟甲基化修饰的改变,包括全基因组水平与DNA特定区域。我们找到了 6个肿瘤中异常表达,并且与预后相关的基因,它们可以作为新的潜在分子靶标,对结直肠癌患者的治疗以及预后管理,提供一定程度上的帮助。