研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,约占泌尿系统恶性肿瘤的3%。RCC由于缺乏早期的特异性诊断指标,导致约有20%~30%的患者在诊断肾癌时已发生转移,另外还有25%的病人在根治性肾切除或保留肾单位的手术后可发生转移,且RCC可转移至全身各处。文献报道RCC患者如果出现肝、骨和脑转移,或转移部位超过2个,均提示预后差。目前关于RCC转移相关的分子主要包括两大类:其中一类为其表达增加可以促进肿瘤转移导致预后较差的分子,包括金属基质蛋白酶类(matrix metal1oproteinases,MMPs)、丝氨酸蛋白酶类、CD44及促血管生成因子,而另外一类表现为其水平的降低或缺失可以导致肿瘤进展,如钙黏素家族、VHL基因和PTEN基因等。然而,这些分子的具体作用机制尚未完全清楚。因此,研究肾癌转移相关的分子机制对肾癌患者,尤其是转移性肾癌患者的临床诊治具有重要意义。RSK4是核糖体S6蛋白激酶(ribosomal s6 kinase,RSK)家族成员之一,在细胞的增殖活化中有一定作用。作为RSK家族新兴的成员之一,其具体作用机制并不明确,有文献报道其在乳腺癌、卵巢癌中异常表达,说明其在肿瘤的发生发展中存在一定的作用。我们前期研究发现,在肾细胞癌中RSK4的表达显著高于正常肾组织,且RSK4的高表达与肾癌患者的不良预后相关。分子机制研究提示过表达RSK4可以促进肾癌细胞系的细胞周期进展及侵袭迁移能力,且过表达RSK4的RCC细胞系更容易发生转移,提示RSK4可能为RCC恶性进展及转移的关键分子之一。然而RSK4促进肾癌转移进展的具体分子机制尚未完全明确。通过综述文献发现RSK4与肾癌转移及预后相关分子MMP-9及CD44之间可能存在一定的相关性,表现在Ras-MEK-ERK通路的活化可以调节MMP-9基因的转录及表达,而MMP-9又可以与CD44的胞外域相结合进一步调节转录。RSK4作为Ras-MEK-ERK通路的下游,可能参与了对MMP-9的调控,进而影响CD44的表达与功能。通过文献与课题组的前期研究发现,RSK4可能与经典mTOR通路下游的rpS6以及Wnt下游的GSK3β及β-Catenin存在相互作用,那么RSK4是否通过此网络调控了MMP-9及CD44的表达?正是本研究想要解决的问题。目的1.研究RSK4、MMP-9、CD44在原发性及转移性肾细胞癌中的表达,为之后的深入研究提供基础;2.研究三者在原发性及转移性肾细胞癌中表达的相关性,并分析三者的表达与患者临床病理特征的关系;3.初步探讨RSK4、MMP-9、CD44在RCC细胞系中的表达及其相互功能的分子机制。方法1.采用免疫组织化学EnVision法检测52例pRCC及48例mRCC标本中RSK4、MMP-9和CD44蛋白的表达;2.采用卡方检验分析RSK4、MMP-9和CD44蛋白表达的相关性及其与患者临床病理特征的关系;3.采用Kaplan-Meier法及Cox回归模型分析三者的表达与患者的预后关系;4.采用慢病毒感染技术建立过表达和低表达RSK4的RCC细胞系ACHN,并通过Western blot和qRT-PCR从蛋白和mRNA水平验证;5.应用蛋白免疫印迹技术检测过表达和低表达RCC细胞系ACHN中CD44、MMP-9、rpS6、p-rpS6、GSK3β及β-catenin的表达;6.应用免疫组织化学EnVision法检测pRCC及mRCC标本中β-catenin蛋白的表达并采用卡方检验分析其表达的相关性。结果1.52例pRCC标本中,RSK4、CD44及MMP-9的阳性率分别为44.2%(23/52)、34.6%(18/52)及69.2%(36/52),而三者在48例mRCC标本中,阳性率分别为75%(36/48)、68.75%(33/48)及91.7%(44/48);2.经统计学分析,RSK4、CD44及MMP-9在mRCC中的表达高于pRCC(RSK4:P=0.002;MMP-9:P=0.002;CD44:P=0.001);在mRCC中,相关分析发现三者之间的表达呈正相关性(P=0.008);进一步两两相关分析发现RSK4与CD44(P=0.019)、MMP-9与CD44(P=0.05)的表达之间表达存在正相关性,而RSK4与MMP-9(P=1.00)未见明确相关性。RSK4、CD44及MMP-9的表达与mRCC患者的年龄、性别和肿瘤的Fuhrman分级、转移部位之间未见明确相关性(P>0.05);3.29例mRCC的中位生存时间为36个月(6-99个月)。单因素生存分析发现,MMP-9的表达与mRCC患者的转移后生存期相关(p=0.038),RSK4和CD44蛋白的表达以及患者的年龄、性别、Fuhrman分级和转移部位均尚不能预测患者RCC转移后的生存期(P>0.05);4.qRT-PCR和Western Blot实验结果显示,过表达RSK4的ACHN细胞系中,RSK4的mRNA和蛋白水平显著高于对照组,且其相关的分子CD44,MMP-9蛋白水平的表达也相应升高;5.Western Blot实验结果显示RSK4过表达时,rpS6,p-rpS6,GSK3β及β-catenin的表达水平均有升高。6.免疫组织化学染色证实在原发及转移性肾癌中,β-catenin在pRCC中的阳性率为65.7%(23/35),mRCC中的阳性率为39.1%(9/23),经卡方检验,差异有统计学意义(P=0.046)。结论1.发现RSK4,MMP-9,CD44在原发性及转移性RCC中的表达情况有显著差异,在转移性RCC中,三者的表达情况明显增强,提示三者可能作为RCC侵袭迁移的关键分子;2.发现RSK4与CD44、MMP-9与CD44的表达之间表达存在正相关性,提示其在转移性RCC中潜在的作用机制;3.在过表达RSK4的ACHN肾癌细胞系中,CD44,MMP-9,rpS6,p-rpS6,GSK3β及β-catenin的表达水平均有升高,且在原发性及转移性RCC中β-catenin的表达情况有显著差异,提示RSK4可能通过rpS6、GSK3β、β-catenin调节MMP-9及CD44的表达,最终介导肾癌侵袭转移。