重组工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指由重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术。重组工程在常规基因克隆方法难以进行或效率极低(如待克隆或修饰的DNA片段过大、合适的酶切位点难以寻找、凝胶回收难以进行等等,此时常规基因克隆方法难以进行或效率极低)时有着极大的优势。而且PCR扩增也可能引入错配碱基、DNA片段经紫外线照射等操作也可能发生基因突变。重组工程则避免了这些烦琐操作步骤,可实现高效的基因克隆和修饰,已逐渐成为常规的克隆手段。重组工程中的重组酶主要是来源自λ噬菌体三个基因,其中exo(Redα)编码DNA5’端至3’端的外切酶Exo,其作用于双链DNA分子而产生3’端突出的分子；bet (Redβ)编码单链结合蛋白,其结合在由Exo作用而形成的DNA分子的3’突出端,同时还行使重组酶活性,即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；Gam基因编码的Gam蛋白的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解,这三个基因也就是通常意义上的重组酶基因。recA基因可增加重组的效率。由于重组工程可以短至36个碱基对的同源区域之间实现同源重组,就使得转化线性双链DNA至大肠杆菌而对其基因进行修饰成为可能。此线性双链DNA而通过一步的PCR手段而一步获得。本论文提供了一种通过寡核苷酸介导的重组工程手段来实现大肠杆菌的基因敲除和基因点突变的方法。首先是通过重组工程将含有同源臂的蔗糖6-果糖转移酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(neo)的基因盒整合至待修饰的基因,含同源臂的sacB-neo基因盒由PCR获得。再将含同源臂的寡核苷酸通过重组工程与基因组上的同源序列进行同源重组而将蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因去除,从而实现无任何碱基冗余的基因敲除和点突变。基因敲除的寡核苷酸设计与靶基因两侧的碱基序列一致,点突变的寡核苷酸则在寡核苷酸中引入需要突变的碱基。此实验方法用来实现LacZ基因的敲除、LacZ基因的点突变、RhaSR基因的敲除和pheS基因的点突变。