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3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)因其优良的性质和广泛的应用前景,被美国能源部列为全球12大最具潜力的化工产品之一。但目前生物法合成3-HP最主要的问题其产量较低,因此开发优良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大肠杆菌(E.coli W3110)为出发菌株,构建了3-HP的合成代谢途径,并在途径中敲除了副产物合成的相关途径,并引入辅酶再生途径,构建了优良的3-HP合成工程菌,并对工程菌生产3-HP的能力进行了探索,具体研究内容如下:(1)克隆来源于K.pneumoniae DSM 2026甘油脱水酶基因dha B及甘油激活因子基因gdr A,得到重组质粒p ACYCDuet-tac-dha B1-4质粒和p Trc99a-dha B1-4质粒;利用MBTH方法检测甘油脱水酶酶活,测得E.coli BL21(DE3)/p ACYCDuet-tac-dha B1-4甘油脱水酶酶活为2.00 U/m L,比酶活为8.94 U/mg;E.coli BL21(DE3)/p Trc99a-dha B1-4甘油脱水酶酶活为2.14 U/m L,比酶活为9.59 U/mg。克隆实验室前期突变的巴西固氮螺菌(A.brasilense)的内源性基因α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因TUkgsadh,得到重组质粒p CDFDuet-tac-TUkgsadh;测得E.coli BL21(DE3)/p CDFDuet-tac-TUkgsadh酶活为0.68 U/m L,比酶活为3.11 U/mg。通过化学转化法,得到重组菌E.coli BL21(DE3)(p CDFDuet-tac-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4)和E.coli BL21(DE3)(p CDFDuet-tac-TUkgsadh/p Trc99a-dha B1-4)。上述菌株好氧发酵35小时后,3-HP的最高产量分别为1.09 g/L和0.41 g/L。(2)克隆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的甘油-3-磷酸脱氢酶基因gpd1和大肠杆菌中细胞膜上转运蛋白——吡啶核苷酸转氢酶基因sth A。在重组质粒p CDFDuet-tac-TUkgsadh基础上,构建了辅酶再生的串联重组质粒p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和p CDFDuet-tac-sth A-TUkgsadh。结果表明以乙醛为底物时,E.coli BL21(DE3)/p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和E.coli BL21(DE3)/p CDFDuet-tac-sth A-TUkgsadh的醛脱氢酶的比酶活是E.coli BL21(DE3)/p CDFDuet-tac-TUkgsadh的2.04倍和3.03倍,说明辅酶再生基因的表达有利于提高醛脱氢酶的活性。(3)敲除形成副产物1,3-PDO的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqh D,得到E.coli W3110_?yqh D(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶微好氧发酵35小时,3-HP产量达到4.46g/L,相比未敲除yqh D基因的菌株,其3-HP产量提高了9.42倍。敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glp R基因,得到E.coli W3110_?glp R(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶微好氧发酵35小时,3-HP产量达到4.02g/L,相比未敲除glp R基因的菌株,其3-HP产量提高了8.40倍。本课题针对3-羟基丙酸合成过程中醛脱氢酶与甘油脱水酶酶活不平衡、氧化还原电势不平衡、代谢副产物途径竞争等问题利用分子手段对大肠杆菌合成3-羟基丙酸的代谢途径进行系统构建与优化,为3-羟基丙酸产量的提高奠定了一定的理论基础。