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普洱茶树(Camellia assamica)的叶片中天然携带的内生菌参与了普洱茶制品生产的诸多过程，势必为普洱茶制品引入许多微生物源化合物。尽管我们对普洱茶树植物代谢产物及其保健功效已有了诸多了解，但目前国内外针对普洱茶树叶片内生菌及其微生物源活性代谢产物的研究却并不多见。已有的研究显示，茶树植物叶片具有丰富的拮抗性内生菌种质，故从新鲜普洱茶树叶片中勘探微生物拮抗型内生菌种质，利用其生物活性物质抑制腐败细菌和产毒真菌的增殖，是应对食品微生物污染问题的一种解决方法。同时，对于普洱茶树叶片内生菌及其活性代谢产物的研究，可进一步扩展我们对于普洱茶制品中含有的微生物来源生物活性物质的理解，对于寻找与普洱茶制品保健功能相关联的潜在微生物源分子，具有一定参考价值。本研究从新鲜普洱茶树叶片样品中分离、筛选得到一株真菌拮抗型内生贝莱斯芽孢杆菌FZ06，并以此菌株为出发菌，对其基因组次级代谢产物合成能力、所产抗菌物质的分子结构及对于食品腐败细菌和产毒真菌的抑制作用进行研究。所得研究结果和结论主要如下：
(1)利用培养依赖型的方法，在新鲜普洱茶树叶片样品中分离得到32株内生细菌和14株内生真菌。利用对峙培养法和牛津杯法筛选得到抗菌活性最强的内生细菌FZ06，通过菌株形态、生理生化指标和16SrDNA序列分析，确定内生细菌FZ06为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌种的一员，命名为BacillusvelezensisFZ06。抗菌活性物质特性分析结果显示，该菌株发酵物中抗菌活性物质的抗菌活性可在100℃水浴30min的热处理条件下良好保持，在4℃环境中稳定保持28天以上，且其在pH值2~10范围内有很好的酸、碱耐受性，其发酵物中的抗菌活性物质可用无水甲醇萃取，且未在其萃取残渣中检测到抗菌活力。
(2)采用Illumina二代测序技术获取了内生细菌B.velezensisFZ06的全基因组框架图序列，综合使用多种基因组注释服务系统，对该菌株的全基因组框架图序列进行基因组功能分析。COG、GO及KEGG功能分类注释的结果显示，该菌株具有较为完善的生长、代谢相关能力。VFDB毒力因子注释分析未在该菌株的基因组中发现涉及毒素合成的关键基因。泛基因组分析结果表明，该菌株的特异基因数远高于大部分近缘菌株，在进化水平上不同于其他贝莱斯芽孢杆菌。使用antiSMASH软件分析该菌株的次级代谢产物合成能力，最终在其基因组中整合、识别了三种NRPS产物的合成基因簇，以及四种PKS产物的合成基因簇。
(3)选择无水甲醇萃取结合SephadexLH-20柱层析法对B.velezensisFZ06的抗菌产物进行提取、分离及纯化，收集具有相应抗菌活性的纯化组分。采用UPLC-MS/MS技术，结合针对该菌株基因组的NRPS产物预测结果，对其抗菌产物进行结构鉴定。最终鉴别到3类共15种抗菌脂肽类物质，分别为C12-Leu7-surfactin、C13-Leu7-surfactin、C14-Leu7-surfactin、C15-Leu7-surfactin、C16-Leu7-surfactin、C14-iturinA、C15-iturinA、C16-iturinA、C17-iturinA、C15-Ala6-fengycin、C16-Ala6-fengycin、C17-Ala6-fengycin、C15-Val6-fengycin、C16-Val6-fengycin和C17-Val6-fengycin。抑菌谱试验结果显示，目标脂肽提取物对于典型食品腐败细菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和蜡样芽孢杆菌)和产毒真菌(黑曲霉、黄曲霉、寄生曲霉和尖孢镰刀菌)均具有良好的抑制效果。目标脂肽提取物对革兰氏阴性细菌的最小抑菌浓度(MIC)约为1024μg/mL，对革兰氏阳性菌的MIC则分布在512～2048μg/mL，对产毒真菌的MIC分布在128～256μg/mL。
(1)利用培养依赖型的方法，在新鲜普洱茶树叶片样品中分离得到32株内生细菌和14株内生真菌。利用对峙培养法和牛津杯法筛选得到抗菌活性最强的内生细菌FZ06，通过菌株形态、生理生化指标和16SrDNA序列分析，确定内生细菌FZ06为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌种的一员，命名为BacillusvelezensisFZ06。抗菌活性物质特性分析结果显示，该菌株发酵物中抗菌活性物质的抗菌活性可在100℃水浴30min的热处理条件下良好保持，在4℃环境中稳定保持28天以上，且其在pH值2~10范围内有很好的酸、碱耐受性，其发酵物中的抗菌活性物质可用无水甲醇萃取，且未在其萃取残渣中检测到抗菌活力。
(2)采用Illumina二代测序技术获取了内生细菌B.velezensisFZ06的全基因组框架图序列，综合使用多种基因组注释服务系统，对该菌株的全基因组框架图序列进行基因组功能分析。COG、GO及KEGG功能分类注释的结果显示，该菌株具有较为完善的生长、代谢相关能力。VFDB毒力因子注释分析未在该菌株的基因组中发现涉及毒素合成的关键基因。泛基因组分析结果表明，该菌株的特异基因数远高于大部分近缘菌株，在进化水平上不同于其他贝莱斯芽孢杆菌。使用antiSMASH软件分析该菌株的次级代谢产物合成能力，最终在其基因组中整合、识别了三种NRPS产物的合成基因簇，以及四种PKS产物的合成基因簇。
(3)选择无水甲醇萃取结合SephadexLH-20柱层析法对B.velezensisFZ06的抗菌产物进行提取、分离及纯化，收集具有相应抗菌活性的纯化组分。采用UPLC-MS/MS技术，结合针对该菌株基因组的NRPS产物预测结果，对其抗菌产物进行结构鉴定。最终鉴别到3类共15种抗菌脂肽类物质，分别为C12-Leu7-surfactin、C13-Leu7-surfactin、C14-Leu7-surfactin、C15-Leu7-surfactin、C16-Leu7-surfactin、C14-iturinA、C15-iturinA、C16-iturinA、C17-iturinA、C15-Ala6-fengycin、C16-Ala6-fengycin、C17-Ala6-fengycin、C15-Val6-fengycin、C16-Val6-fengycin和C17-Val6-fengycin。抑菌谱试验结果显示，目标脂肽提取物对于典型食品腐败细菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和蜡样芽孢杆菌)和产毒真菌(黑曲霉、黄曲霉、寄生曲霉和尖孢镰刀菌)均具有良好的抑制效果。目标脂肽提取物对革兰氏阴性细菌的最小抑菌浓度(MIC)约为1024μg/mL，对革兰氏阳性菌的MIC则分布在512～2048μg/mL，对产毒真菌的MIC分布在128～256μg/mL。