目的观察活血解毒方候选活性成分对视网膜血管内皮细胞功能的影响,筛选药效最佳的活性成分,确认活血解毒方防治糖尿病视网膜病的物质基础;并探讨活血解毒方活性成分对Hippo/Notch信号通路的影响,揭示活性成分的药理机制。方法1.选用视网膜内皮细胞,将内皮细胞分为对照组（5.5 mM葡萄糖）、高糖组（25 mM葡萄糖）以及活性成分各剂量组。常规培养3天后,首先采用CCK-8法检测细胞活力,确定药物的毒性及有效剂量范围。根据CCK-8法确定的有效剂量,采用细胞增殖、细胞迁移、内皮管道形成方法,观察活血解毒方活性成分对高糖培养下内皮细胞的影响,验证其成分的活性。2.选取药效最佳的活性成分,采用Real-time PCR法检测内皮细胞中Hippo（TEAD1）及Notch（Notch1、Notch2、HES1）信号通路中mRNA的表达水平。采用蛋白印迹法检测内皮细胞中Hippo（MST1、P-MST1/2、YAP1、P-YAP、TEAD1）及Notch（Notch1、Notch2、DLL1、HES1）信号通路中蛋白的表达水平。结果1.CCK-8法检测细胞活力:与对照组比较,高糖组促进细胞活力升高;与高糖组比较,组分 T3（20μg/ml-60 μg/ml）抑制细胞活力,组分 T5（0.001 μg/ml-1 μg/ml）抑制细胞活力,人参皂苷Rb3（100μg/ml-200μg/ml）抑制细胞活力。发现单宁酸、橙皮苷、四氢黄连碱、绞股蓝总皂苷及组分T4的毒性较大或无效。2.Transwell法检测细胞迁移:与对照组比较,高糖组的细胞迁移数增多;与高糖组比较,组分T3、组分T5及人参皂苷Rb3均减少了细胞迁移数。3.内皮管道形成实验:与对照组比较,高糖组的管道形成总长度升高;与高糖组比较,组分T3及人参皂苷Rb3减少了管道形成总长度。4.BrdU法检测细胞增殖:与对照组比较,高糖组BrdU阳性细胞率增加;与高糖组比较,组分T3及人参皂苷Rb3抑制了 BrdU 阳性细胞率。5.Real-time PCR检测结果:与对照组比较,高糖组细胞中HES1 mRNA表达下调,高糖组细胞中TEAD1、Notch1及Notch2 mRNA表达上调;与高糖组比较,组分T3组细胞中HES1 mRNA表达上调,组分T3细胞中TEAD1、Notch1及Notch2 mRNA表达下调,人参皂苷Rb3细胞中Notch1 mRNA表达下调。6.蛋白印记法检测结果:与对照组比较,高糖组细胞中P-MST1/2、MST1、P-YAP1、YAP1、TEAD1、Notch1及Notch2蛋白表达上调,高糖组细胞中表达DLL1及HES1下调;与高糖组比较,组分 T3 细胞中 P-MST1/2、MST1、P-YAP1、YAP1、TEAD1、Notch1及Notch2蛋白表达下调,组分T3细胞中HES1蛋白表达上调,人参皂苷Rb3细胞中P-YAP1、YAP 1及Notchl蛋白表达下调。结论1.通过细胞活力、迁移、增殖等实验筛选出活血解毒方药效最佳的活性成分为组分T3及人参皂苷Rb3,提示了在糖尿病视网膜病变中活血解毒方的活性成分可能是组分T3及人参皂苷Rb3,两者通过调控内皮细胞的功能防治糖尿病视网膜病变。2.实时荧光定量PCR或蛋白印记法结果发现组分T3及人参皂苷Rb3改变了Hippo/Notch信号通路核心分子的基因或蛋白表达水平,提示了活血解毒方的活性成分可能通过调控Hippo/Notch信号通路调控内皮细胞的功能。